[發明專利]一種DNA突變及甲基化狀況檢測方法

在審

• 申請號: 201710909013.4
• 申請日: 2017-09-29
• 公開（公告）號: CN109593839A
• 公開（公告）日: 2019-04-09
• 發明（設計）人: 馮延葉;王永亭
• 申請（專利權）人: 上海交通大學
• 主分類號: C12Q1/6869
• 分類號: C12Q1/6869;C12Q1/6806
• 代理公司: 上海一平知識產權代理有限公司 31266
• 代理人: 王正君;陸鳳

1.一種同時檢測DNA突變和甲基化位點的方法，其特征在于，包括步驟：

(a)提供一待測樣本；

(b)對所述待測樣本進行第一修復，從而獲得經第一修復的待測樣本；

(c)對所述經第一修復的待測樣本進行第二修復，從而獲得經第二修復的待測樣本；

(d)對所述經第二修復的待測樣本，用接頭序列進行接頭連接；

(e)對接頭連接的待測樣本進行文庫修復，從而獲得文庫；

(f)對所述文庫進行預擴增，從而獲得預擴增產物；

(g)對所述預擴增產物進行堿基轉換處理，從而獲得轉換產物；

(h)對所述轉換產物進行PCR富集擴增，從而獲得轉換產物的擴增產物；

(i)對所述轉換產物的擴增產物進行測序；以及

(j)分析所述的測序數據，從而獲得檢測結果，所述檢測結果包括：DNA突變和甲基化位點。

2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一修復包括DNA分子的修復。

3.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述第二修復包括DNA分子的末端修復。

4.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(d)中，所述接頭序列包括第一接頭和第二接頭，其中所述第一接頭為SEQ ID NO.:1所示的P1和SEQ ID NO.:2所示的P2所形成的雙鏈結構：

P1：

5’-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACNNNNNNNNNACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTNNNNGC-3’；(SEQ ID NO.:1)

P2：

5’-GCNNNNAGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCAC[Index]ATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG-3’；(SEQ ID NO.:2)

所述第二接頭為SEQ ID NO.:3所示的P3和SEQ ID NO.:4所示的P4所形成的雙鏈結構：

P3：

5’-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACNNNNNNNNNACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTDDDDGC-3’；(SEQ ID NO.:3)

P4：

5’-AGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCAC[Index]ATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG-3’(SEQ ID NO.:4)。

5.如權利要求4所述的方法，其特征在于，所述第一接頭設有第一分子標簽。

6.如權利要求4所述的方法，其特征在于，所述第二接頭設有第二分子標簽。

7.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(g)中，用重亞硫酸鹽類或酶法進行處理，進行堿基轉換。

8.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(j)中，還包括步驟：將步驟(f)獲得的擴增產物與待測樣本和參考基因組序列進行比較，從而獲得待測樣本的突變位點。

9.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(j)中，還包括步驟：將步驟(i)獲得的擴增產物與步驟(f)獲得的擴增產物和參考基因組序列(進行比較，從而獲得待測樣本的甲基化位點。

10.一種同時檢測突變位點和甲基化位點的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括：

(i)修復試劑；

(ii)接頭連接試劑；

(iii)擴增試劑；

(iv)堿基轉換試劑；和

(v)測序試劑。