[發明專利]一種基于水凝膠包裹單細胞的方法及產品和在制備通用型紅細胞中的應用

有效

• 申請號: 201710908231.6
• 申請日: 2017-09-29
• 公開（公告）號: CN107760665B
• 公開（公告）日: 2020-05-08
• 發明（設計）人: 王本;趙玥綺;范明杰;唐睿康
• 申請（專利權）人: 浙江大學
• 主分類號: C12N11/089
• 分類號: C12N11/089;C12N5/078
• 代理公司: 杭州天勤知識產權代理有限公司 33224
• 代理人: 胡紅娟

1.一種基于水凝膠包裹單細胞的方法，其特征在于，包括：

(1)1g油酸和1.27g TSTU溶入無水DMF，加入0.1ml三乙胺，氮氣保護下，35℃條件下，反應8h；停止反應，減壓蒸出DMF，加乙醚洗滌，得到油酸-琥珀酰亞胺酯；

將含有189.75mg油酸-琥珀酰亞胺酯的DMF溶液通過恒壓滴液漏斗緩慢滴入含1g聚氧乙烯二胺的DMF溶液中，其中，聚氧乙烯二胺MW＝2000，溶液中還含有0.1ml三乙胺，滴加完畢，反應2h，停止反應，減壓蒸出DMF，加乙醚洗滌，得到(E)-N-(2-(2-氨基乙氧基)乙基-9-硬酯酰胺)；

將0.9g(E)-N-(2-(2-氨基乙氧基)乙基-9-硬酯酰胺)和43.7mg丁二酸酐溶于DMF，加入5ml吡啶，氮氣保護，油浴50℃，反應4h減壓蒸出DMF，加乙醚洗滌，得到(E)-(4-(2-(2-(9-硬酯酰胺)乙氧基)乙基)氨基)-氧代丁酸；

將0.8g(E)-(4-(2-(2-(9-硬酯酰胺)乙氧基)乙基)氨基)-氧代丁酸和121.8mg TSTU溶于無水DMF，加入0.1ml三乙胺，氮氣保護，油浴35℃，反應4h，停止反應，減壓蒸出DMF，加乙醚洗滌，得到油酰胺聚氧乙烯-4-丁酰胺-4-N-羥基琥珀酰亞胺酯，

(2)取濃度為2mg/mL油酰胺聚氧乙烯-4-丁酰胺-4-N-羥基琥珀酰亞胺酯和濃度為3mg/mL辣根過氧化物酶HRP，室溫下攪拌反應1h，再用超濾管離心，棄掉未反應的分子，得到BAM-HRP，

(3)將收集的人全血離心，棄去上清液，用PBS緩沖液洗滌兩次，得到紅細胞體系；向紅細胞體系中加入BAM-HRP，使體系中BAM-HRP的濃度為3mg/mL，搖勻，室溫靜置10min進行反應，反應完成后，離心收集沉淀，用PBS緩沖液洗滌一次，得到表面錨定有BAM-HRP的細胞體系，

(4)活化PSA：取0.125g聚唾液酸PSA，加入含10ml水的燒杯中，放在磁力攪拌器上，300～400rpm下攪拌；再取0.3g EDC和0.2g NHS，倒入燒杯，活化1h；再加入0.45g的鹽酸酪胺，反應4h，反應結束前，提前半小時準備透析袋，將剪好的透析袋放入另一燒杯中，倒入無水乙醇；在85℃下水浴加熱活化；取出透析袋用夾子封好一端，將溶解的PSA用槍轉移至透析袋內，并用夾子封閉，放入裝有水的燒杯內，將燒杯放在磁力攪拌器上，透析2天，去除未反應的小分子，凍干48小時，得到鹽酸酪胺-聚唾液酸，

(5)向表面錨定有BAM-HRP的細胞體系中加入鹽酸酪胺-聚唾液酸和雙氧水，體系中鹽酸酪胺-聚唾液酸的濃度為10mg/mL，雙氧水的濃度為1mmol/L，搖勻靜置30min，經酰胺化反應后，離心收集沉淀，用PBS緩沖液洗滌兩次，得到表面被水凝膠包裹的紅細胞。

2.一種如權利要求1所述方法制備的表面包裹有水凝膠的紅細胞。

3.如權利要求2所述的表面包裹有水凝膠的紅細胞在制備通用型紅細胞中的應用。