[發(fā)明專利]循環(huán)腫瘤細(xì)胞多種標(biāo)志物聯(lián)合檢測(cè)試劑盒及其應(yīng)用

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710899563.2
• 申請(qǐng)日: 2017-09-28
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN107586839A
• 公開(kāi)（公告）日: 2018-01-16
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 樊嘉;楊欣榮;孫云帆;郭瑋;周儉
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院
• 主分類號(hào): C12Q1/6886
• 分類號(hào): C12Q1/6886;C12Q1/686;C12Q1/02
• 代理公司: 上海容慧專利代理事務(wù)所(普通合伙)31287
• 代理人: 于曉菁

1.一種循環(huán)腫瘤細(xì)胞多種標(biāo)志物聯(lián)合檢測(cè)試劑盒，其特征在于，包含：

1)外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞富集試劑；

2)RNA抽提試劑；

3)RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑；

4)標(biāo)志物EpCAM、CD133、CD90和CK19的熒光標(biāo)記Taqman探針及其特異性引物對(duì)；

5)qPCR反應(yīng)體系試劑。

2.如權(quán)利要求1所述的循環(huán)腫瘤細(xì)胞多種標(biāo)志物聯(lián)合檢測(cè)試劑盒，其特征在于所述外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞富集試劑采用RosetteSep Human CD45Depletion Cocktail試劑。

3.如權(quán)利要求1所述的循環(huán)腫瘤細(xì)胞多種標(biāo)志物聯(lián)合檢測(cè)試劑盒，其特征在于所述標(biāo)志物EpCAM、CD133、CD90和CK19的熒光標(biāo)記Taqman探針?lè)謩e為：

EpCAM probe:FAM-ACGGCGACTTTTGCCGCAGCT-TAM；

CD133probe:FAM-ACCAGCGTGAAAACTAGCCTGCGGTC-TAM；

CD90probe:FAM-TCAGCCTGACCCGTGAGACAAAGAAGC-TAM；

CK19probe:FAM-CCGCTCCGGGCACCGATCT-TAM。

4.如權(quán)利要求1所述的循環(huán)腫瘤細(xì)胞多種標(biāo)志物聯(lián)合檢測(cè)試劑盒，其特征在于所述標(biāo)志物EpCAM、CD133、CD90和CK19的特異性引物對(duì)分別為：

EpCAM-F：5’-CTCGCGTTCGGGCTTCT-3’；

EpCAM-R：5’-TGTAGTTTTCACAGACACATTCTTCCT-3’；

CD133-F：5’-AGCTTGCACCAACAAAGTACACA-3’；

CD133-R：5’-AAGCACAGAGGGTCATTGAGAGA-3’；

CD90-F：5’-CAGCAGTTCACCCATCCAGTAC-3’；

CD90-R：5’-CCCCCACAGTGCCAAAGA-3’；

CK19-F：5’-CAGGTCAGTGTGGAGGTGGAT-3’；

CK19-R：5’-TCGCATGTCACTCAGGATCTTG-3’。

5.如權(quán)利要求1所述的循環(huán)腫瘤細(xì)胞多種標(biāo)志物聯(lián)合檢測(cè)試劑盒，其特征在于還包括預(yù)測(cè)公式：logit(p＝HCC)＝-2.15+0.74×E_EpCAM+0.65×E_CD133+0.34×E_CD90+0.99×E_CK19，其中E_EpCAM、E_CD133、E_CD90和E_CK19分別代表EpCAM、CD133、CD90和CK19四種標(biāo)志物mRNA的相對(duì)表達(dá)量，該相對(duì)表達(dá)量使用2^-ΔΔCt計(jì)算法獲得，所述預(yù)測(cè)公式以0.57為診斷切點(diǎn)。

6.一種循環(huán)腫瘤細(xì)胞的檢測(cè)方法，其特征在于，包括步驟：

a)應(yīng)用RosetteSep稀有細(xì)胞富集技術(shù)富集4-6mL外周血中循環(huán)腫瘤細(xì)胞；

b)抽提總RNA并逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA；

c)采用熒光標(biāo)記Taqman探針qRT-PCR技術(shù)同時(shí)檢測(cè)CTC表面四種干性細(xì)胞標(biāo)志物EpCAM、CD133、CD90和CK19；

d)分別計(jì)算四種干性細(xì)胞標(biāo)志物的mRNA相對(duì)表達(dá)量，使用2^-ΔΔCt計(jì)算法；

e)最后分別將四種干性細(xì)胞標(biāo)志物的mRNA相對(duì)表達(dá)量結(jié)果代入計(jì)算公式：logit(p＝HCC)＝-2.15+0.74×E_EpCAM+0.65×E_CD133+0.34×E_CD90+0.99×E_CK19，得出個(gè)體多干細(xì)胞標(biāo)志物聯(lián)合預(yù)測(cè)值，預(yù)測(cè)值按0.57作為診斷切點(diǎn)。