[發明專利]一種可調控酶比例的可逆雙酶共固定化方法

有效

• 申請號: 201710896326.0
• 申請日: 2017-09-28
• 公開（公告）號: CN107760666B
• 公開（公告）日: 2020-10-02
• 發明（設計）人: 楊屹;楊燁;蘇萍
• 申請（專利權）人: 北京化工大學
• 主分類號: C12N11/14
• 分類號: C12N11/14;C12N11/18
• 代理公司: 北京五月天專利商標代理有限公司 11294
• 代理人: 吳寶泰

1.一種可調控酶比例的可逆雙酶共固定化方法，其特征在于，首先合成馬來酰亞胺基-多巴胺衍生物，將其與多巴胺通過超聲法鍵合到磁性四氧化三鐵納米粒子表面，制備氨基-馬來酰亞胺基修飾的雙功能化磁性納米粒子，然后通過縮合和邁克爾加成反應將5’ 羧基修飾的單鏈DNA P1和5’ 巰基修飾的單鏈DNA P2鍵合到雙功能化磁性納米粒子表面，制備單鏈DNA雙功能化的磁性納米粒子；制備5’ 巰基修飾的單鏈DNA標記的酶C1-GOx和C2-HRP，由于P1與C1以及P2與C2為完全互補序列，因此采用DNA互補介導固定化技術實現GOx和HRP的共固定化。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，包括以下步驟：

（1）將多巴胺和多巴胺的馬來酰亞胺基衍生物在超聲條件下與磁性四氧化三鐵納米粒子反應1h，制備多巴胺衍生物修飾的氨基-馬來酰亞胺基雙官能團磁性納米粒子；

（2）將兩條不同序列的5’ 巰基修飾的單鏈DNA C1和C2與三(2-羧乙基)膦鹽酸鹽TCEP在35-40℃條件下反應2-3 h，切斷DNA間形成的二硫鍵，然后將反應后的單鏈DNA經過交聯劑分別制備C1-GOx和C2-HRP，然后在25-30℃條件下反應12-30 h，合成巰基單鏈DNA標記的酶；

（3）將5’ 羧基修飾的單鏈DNA P1和5’ 巰基修飾的單鏈DNA P2與氨基-馬來酰亞胺基雙功能化的磁性四氧化三鐵納米粒子在25-30℃下反應5-7 h，制備單鏈DNA標記的雙功能化磁性納米粒子，然后用BSA對其進行封閉；

（4）將（2）中合成的巰基單鏈DNA標記的酶與（3）中合成的單鏈DNA標記的雙功能化磁性納米粒子在35-40℃反應3-4 h，經過DNA互補介導固定化技術將酶固定到雙功能化磁性納米粒子表面。

3.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，步驟(1)中所述的馬來酰亞胺基多巴胺衍生物的結構式為：

。

4.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，步驟(1)中所述的磁性四氧化三鐵納米粒子的合成方法為水熱法，粒徑為12-18 nm。

5.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，步驟(2)中所述的交聯劑為4-(N-馬來酰亞胺基甲基)環己烷-1-羧酸-3-硫代-N-琥珀酰亞胺酯鈉鹽suflo-smcc，用量為1 mg。

6.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，步驟(2)、(3)中所述的5’ 羧基修飾的單鏈DNA P1和5’ 巰基修飾的單鏈DNA C1，5’ 巰基修飾的單鏈DNA P2和5’ 巰基修飾的單鏈DNAC2為堿基互補配對且堿基數為24。

7.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，步驟(2)中所述的酶的用量為2-4 mg，TCEP濃度為30-40 mM，DNA用量為0.5 OD。

8.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，步驟(3)中所示的氨基-馬來酰亞胺基雙功能化磁性納米粒子的用量為25 mg，DNA用量為0.5 OD。