[發明專利]FXa的檢測試劑及檢測方法

有效

• 申請號: 201710894942.2
• 申請日: 2017-09-28
• 公開（公告）號: CN107796793B
• 公開（公告）日: 2020-04-10
• 發明（設計）人: 徐小龍;桂宗祥
• 申請（專利權）人: 中國科學技術大學
• 主分類號: G01N21/64
• 分類號: G01N21/64;G01N1/38
• 代理公司: 北京集佳知識產權代理有限公司 11227
• 代理人: 溫可睿;趙青朵

技術領域

本發明涉及生化檢測技術領域，尤其涉及FXa的檢測試劑及檢測方法。

背景技術

凝血因子X為維生素K依賴的絲氨酸蛋白酶原，在血液含量為100nM/L。凝血因子X被FIX激活后產生活化凝血因子X(FXa)。FXa在血管出血時被激活，其為體內凝血酶原唯一的生理性激活物，在血液凝固的連鎖反應中起關鍵性作用。研究表明，FXa可以作為體內出血的標志物，與血管內膜增生和動脈粥樣硬化有關，同時FXa與腫瘤細胞的轉移有關。因此，快速準確的檢測出FXa在血液水平十分重要。

隨著酶聯免疫吸附測定技術的發展，目前市面上已經有一些FXa ELISA KIT產品，通用的FXa檢測試劑盒檢測原理為雙抗體夾心法。用純化的FXa抗體包被微孔板，制備成固相抗體，檢測時往包被單抗的微孔中依次加入待測物質，再與HRP標記的FXa抗體結合，形成抗體-抗原-酶標抗體復合物，經過徹底洗滌后加底物TMB顯色。TMB在HRP酶的催化下轉化成藍色，并在酸的作用下轉化成最終的黃色.顏色的深淺和樣品中的待測FX呈正相關。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度(OD值)，通過標準曲線計算樣品中待測FXa濃度。但其ELISA檢測法步驟較多，包括孵育、顯色、洗板等過程，檢測時間較長，通常在3～6h，這樣的時間對于臨床檢測而言過長。另外，還有其他一些檢測FXa的方法，例如，電化學法、凝固法或發色底物法。但這些方法都難免受到血漿中雜蛋白或血紅色素的影響，容易產生誤差。

因此尋找一種能夠快速、準確測量樣品FX含量的技術十分必要。

發明內容

有鑒于此，本發明要解決的技術問題在于提供FXa的檢測試劑及檢測方法。本發明提供的檢測試劑能夠實現對FXa快速、準確的檢測。

本發明提供了一種FXa檢測試劑，由金屬結合蛋白AHP、Tb³⁺、Tris-HCl、Mg²⁺和水制得；所述金屬結合蛋白與Tb³⁺的摩爾為1:(1～3)。

鋱離子(Tb³⁺)能夠與金屬離子結合蛋白AHP結合，由于280nm激發蛋白質產生發射光譜與鋱離子的激發光譜有重疊，二者之間存在熒光共振能量轉移(FRET)，AHP作為供體，Tb³⁺作為受體。FRET程度與供、受體分子的空間距離緊密相關，距離增大，FERT越弱，Tb³⁺的熒光強度越低。鎂離子(Mg²⁺)可以誘導FXa與AHP結合，結合后會使AHP在280nm的發光基團(酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸)與Tb³⁺之間的空間距離增大，從而使Tb³⁺的熒光強度降低。因此，AHP與Tb³⁺之間比例和分子量固定的情況下，FXa含量越高，Tb³⁺熒光強度越低，通過建立FXa與Tb³⁺熒光強度之間的關系，可以通過檢測Tb³⁺的熒光強度判斷樣品中FXa的含量。

本發明中，所述金屬結合蛋白AHP的濃度為4～6nmol/L。所述金屬結合蛋白AHP的濃度為5nmol/L。

AHP與FXa結合體系中存在Tb³⁺和Mg²⁺的情況下，Mg²⁺結合FXa，與AHP不結合。而Tb³⁺與AHP的結合常數很高，在體系中AHP:Tb³⁺的摩爾比為1:(1～3)結合良好，在AHP:Tb³⁺的摩爾比為1:2的情況下，二者能夠完全結合。本發明實施例中，所述金屬結合蛋白與Tb³⁺的摩爾為1:2。

本發明中，所述Tb³⁺的來源為Tb(NO₃)₃·5H₂O。

本發明中，所述Tb³⁺的濃度為8～12nmol/L。

一些具體實施例中，所述Tb³⁺的濃度為10nmol/L。

本發明中，所述Mg²⁺的來源為MgSO₄。

本發明中，所述Mg²⁺的濃度為8～12μmol/L。一些具體實施例中，所述Mg²⁺的濃度為10μmol/L。