[發明專利]一種豬流行性腹瀉病毒疫苗毒CV777與野毒株鑒別引物

有效

• 申請號: 201710890271.2
• 申請日: 2017-09-27
• 公開（公告）號: CN107937603B
• 公開（公告）日: 2020-10-13
• 發明（設計）人: 李學瑞;蘭喜;劉永生;丁耀中;周建華;馬麗娜;王志林
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院蘭州獸醫研究所
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/686;C12N15/11;C12R1/93
• 代理公司: 北京中譽威圣知識產權代理有限公司 11279
• 代理人: 席勇

一種豬流行性腹瀉病毒疫苗毒與野毒株鑒別引物及其制備方法，屬于豬流行性腹瀉病毒的檢測技術領域具體設計PEDV疫苗毒CV777與野毒株，其差異基因序列為：GTCTTCCTGTGGCACCTGAAACAA。對應引物如包括Ps1，其序列為：ACACTATACTATCCCACCG；Pa1，其序列為：TTTCAGGAGCTACATTARG；Pa2，其序列為：CACCCAAAGATCCCAAGA；其中Ps1/Pa1引物對擴增片段長度為505bp；Ps1/Pa2引物對擴增片段長度為793bp；本發明的制備方法包括步驟：RNA的提取、PEDV疫苗株與野毒株RT?PCR鑒別、特異性試驗、敏感性試驗、檢測結果。

技術領域

本發明屬于豬流行性腹瀉病毒的檢測技術領域，具體是一種豬流行性腹瀉病毒疫苗毒CV777與野毒株鑒別引物。

背景技術

豬流行性腹瀉病是由豬流行性腹瀉病毒引起的豬的一種急性腸道傳染病，以水瀉、嘔吐和脫水為特征。其病原屬于冠狀病毒科冠狀毒病屬。豬流行性腹瀉病毒可在豬群中持續存在，各種年齡的豬都易感，尤其是哺乳仔豬，極易感染，發病率可達100％。7日齡以內的乳豬病死率高達100％，給養豬業造成了極大的經濟損失。目前PEDV感染普遍，流行范圍廣，而預防該病的弱毒疫苗也使用較為廣泛，僅靠抗體檢測不能真實的反應豬群的免疫狀態，因此對PEDV進行疫苗株與野毒株的鑒別診斷對于該病的免疫與預防具有重要意義。

發明內容

本研究所要解決的技術問題是，根據豬流行性腹瀉病毒疫苗株CV777，野生毒株等基因組序列比對，發現在豬流行性腹瀉病毒基因組2902-3696之間，野生毒株存在一段長約24bp的堿基序列，疫苗株不存在該序列。我們以這段差異序列為基礎，針對PEDV基因的保守序列以及疫苗株與野毒株的差異設計引物，建立了RT-PCR鑒別方法，并初步將此檢測方法應用于臨床樣品檢測，具有良好的鑒別效果。

本研究針對的病毒為PEDV疫苗毒CV777與野毒株，其差異基因序列為：

GTCTTCCTGTGGCACCTGAAACAA。

所述引物如下。

Ps1，其序列為：ACACTATACTATCCCACCG。

Pa1，其序列為：TTTCAGGAGCTACATTARG。

Pa2，其序列為：CACCCAAAGATCCCAAGA。

其中Ps1/Pa1引物對擴增片段長度為505bp。

Ps1/Pa2引物對擴增片段長度為793bp。

一種豬流行性腹瀉病毒疫苗毒與野毒株鑒別引物的應用，該應用包括一下步驟：

RNA的提取：本實驗方法參照TaKaRaMiNiBESTViralRNA/DNAExtractionKitVer.5.0試劑說明書進行。

PEDV疫苗株與野毒株RT-PCR鑒別：取200μLEP管，建立50μL的一步法RT-PCR反應體系，其中PrimeScript1StepEnzymeMix需要2μL、2×1StepBuffer需要25μL、RNA模板需要8μL、Ps1、Pa1和Pa2引物2.5pmol-10pmol，、RNasefreedH2O需要11μL，混勻后離心；所述一步法RT-PCR反應條件設定為50℃45min；94℃2min；94℃30s，50℃-60℃30s，72℃1min，35個循環；72℃15min；10℃停止；取7μLPCR擴增產物于1.2％的瓊脂糖凝膠進行電泳，觀察擴增結果，并回收目的條帶進行序列測定。