[發(fā)明專利]3D數(shù)字PCR檢測KRAS和BRAF基因突變的引物探針組合物、試劑盒及方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201710888201.3
• 申請日: 2017-09-26
• 公開（公告）號: CN107488727B
• 公開（公告）日: 2020-06-02
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 蔡暢;閆慧婷;王海波
• 申請（專利權(quán)）人: 無錫臻和生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/6886
• 分類號: C12Q1/6886;C12N15/11
• 代理公司: 北京康信知識產(chǎn)權(quán)代理有限責(zé)任公司 11240
• 代理人: 韓建偉;謝湘寧

1.一種3D數(shù)字PCR檢測KRAS和BRAF基因突變的引物探針組合物，其特征在于，所述引物探針組合物包括：

檢測KRAS基因2號外顯子上6種氨基酸突變各自的引物及探針，其中，所述6種氨基酸突變分別為G12A、G12C、G12D、G12V、G12S及G13D；以及

檢測BRAF基因15號外顯子上V600E氨基酸突變的引物及探針，

所述檢測KRAS基因2號外顯子上6種氨基酸突變的引物及探針以及所述檢測BRAF基因15號外顯子上V600E氨基酸突變的引物及探針分別如下表1所示：

表1：

。

2.一種3D數(shù)字PCR檢測KRAS和BRAF基因突變的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括權(quán)利要求1所述的引物探針組合物。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒中擴(kuò)增每個突變位點的引物及探針以引物探針混合液的形式存在。

4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括陰性質(zhì)控品和陽性質(zhì)控品。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的試劑盒，其特征在于，所述陽性質(zhì)控品為含有所述KRAS或BRAF基因突變的DNA與野生型DNA的混合液。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的試劑盒，其特征在于，KRAS-G12A的陽性質(zhì)控品DNA的來源為細(xì)胞系NCI-H1573的DNA，KRAS-G12S的陽性質(zhì)控品DNA的來源為細(xì)胞系A(chǔ)549的DNA，KRAS-G12V的陽性質(zhì)控品DNA的來源為細(xì)胞系NCI-H441的DNA，KRAS-G12D的陽性質(zhì)控品DNA的來源為細(xì)胞系A(chǔ)427的DNA，KRAS-G12C的陽性質(zhì)控品DNA的來源為細(xì)胞系NCI-H2122的DNA，KRAS-G13D的陽性質(zhì)控品DNA的來源為細(xì)胞系HCT116的DNA，BRAF-V600E的陽性質(zhì)控品DNA的來源為細(xì)胞系SK-HEP-1的DNA。

7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括QuantStudio 3D數(shù)字PCR預(yù)混液，所述預(yù)混液包括dNTPs、Taq酶及PCR緩沖液。

8.一種非診斷目的的3D數(shù)字PCR檢測KRAS和BRAF基因突變的方法，其特征在于，所述方法包括：

利用權(quán)利要求2至7中任一項所述的試劑盒配制KRAS和BRAF基因的每個突變位點的PCR反應(yīng)體系；

將各所述突變位點的PCR反應(yīng)體系加樣至數(shù)字PCR芯片中；

將所述數(shù)字PCR芯片放入數(shù)字PCR儀中進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到擴(kuò)增結(jié)果；

將得到所述擴(kuò)增結(jié)果的所述數(shù)字PCR芯片放到芯片掃描儀中進(jìn)行熒光信號掃描，根據(jù)所述熒光信號判讀每個所述突變位點的突變結(jié)果。

9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，每個突變位點的PCR反應(yīng)體系中，野生探針攜帶VIC信號，突變探針攜帶FAM信號，所述熒光信號掃描的結(jié)果中，擴(kuò)增結(jié)果的二維圖按順時針方向依次分為FAM(+)VIC(-)區(qū)、FAM(+)VIC(+)區(qū)、FAM(-)VIC(+)以及FAM(-)VIC(-)區(qū)四個象限，將陽性對照在FAM(+)VIC(-)區(qū)的成簇突變點的FAM最小熒光值記為P，則根據(jù)所述熒光信號判讀每個所述突變位點的突變結(jié)果的步驟包括：

若待測樣本位于FAM(+)VIC(-)區(qū)，且所述待測樣本的FAM熒光值≥P的突變點的數(shù)目≥3，則判定所述待測樣本為陽性樣本；

若待測樣本位于FAM(+)VIC(-)區(qū)，且所述待測樣本的FAM熒光值≥P的突變點的數(shù)目3，則判定所述待測樣本為陰性樣本或低于檢測限。