[發明專利]一種抗疲勞活性柚子皮總黃酮的制備工藝

在審

• 申請號: 201710884697.7
• 申請日: 2017-09-26
• 公開（公告）號: CN107868070A
• 公開（公告）日: 2018-04-03
• 發明（設計）人: 關麗萍;夏亞男;符志楊;綦宇軒;劉炳宇
• 申請（專利權）人: 浙江海洋大學
• 主分類號: C07D311/30
• 分類號: C07D311/30;C07D311/40;A61K8/49;A61P39/06;A23L33/105
• 代理公司: 杭州浙科專利事務所(普通合伙)33213
• 代理人: 吳秉中

技術領域

本發明涉及生物活性物質提取領域，具體是一種抗疲勞活性柚子皮總黃酮的制備工藝。

背景技術

自然界植物千差萬別，種類繁多。它們含有大量天然有機化合物，包括一級代謝產物，也包括大量二級代謝產物。這些產物不僅對植物本身的防御、生理調節起重要作用，而且也對人類的健康做出非常重要的貢獻。隨著人們健康意識的不斷提高，對植物來源的諸多生物活性物質重要性的認識也不斷提高。

柚子皮是柚子的外皮。柚子皮富含蛋白質、有機酸、維生素以及鈣等，還可用于治小兒肺炎、治療凍瘡等。其具有食用、驅除異味、防蚊蟲等功效。

現有技術中柚子皮總黃酮提取方法，工藝粗糙、落后，雜質多，有效成分含量低，導致患者用量過大，不方便服用，嚴重影響了本品在臨床上應用。

發明內容

本發明的目的在于提供一種操作步驟簡單、原料來源廣，槲皮素提取率高，可快速制備得到高純度槲皮素的抗疲勞活性柚子皮總黃酮的制備工藝。

一種抗疲勞活性柚子皮總黃酮的制備工藝，包括乙醇浸泡、超聲提取、萃取和分離純化。力竭運動引起線粒體呼吸電子傳遞鏈中電子和質子漏出，誘發氧自由基生成增加并積累，進而攻擊生物膜系統引起組織細胞的結構和功能損害，造成運動能力下降，成為疲勞發生的重要因素。MDA是氧自由基攻擊生物膜中多不飽和脂肪酸而形成的脂質過氧化產物，其含量高低能直接反映體內脂質過氧化的速率和強度。GSH-Px和SOD是體內清除氧自由基重要的抗氧化酶，SOD催化O₂^-·與H⁺反應生成H₂O₂，而GSH-Px主要催化還原型谷胱甘肽(GSH) 與H₂O₂反應，從而保護細胞膜中含巰基蛋白的還原狀態。可見，SOD和GSH-Px形成連鎖反應能有效地清除氧自由基并阻斷脂質過氧化反應，保護組織細胞的結構和功能，SOD和 GSH-Px的水平可以間接反映機體清除氧自由基的能力。本發明得到的槲皮素可以明顯提高力竭運動疲勞動物血清抗氧化酶活力，減輕脂質過氧化反應，提高動物運動能力。

作為優選，萃取步驟為：用蒸餾水將粗提取溶解后，采用乙酸乙酯多次萃取，合并萃取液，旋轉蒸干后得到乙酸乙酯萃取物。粗提取與蒸餾水的質量體積比為1g：7～15mL。乙酸乙酯萃取次數為2～7次，每次用量為蒸餾水體積的2～5倍。先用蒸餾水溶解后用乙酸乙酯萃取，可除去粗提取中不溶于乙酸乙酯的水溶性物質，對槲皮素作初步純化。槲皮素在乙酸乙酯中的溶解度遠大于在蒸餾水中的溶解度，減少了槲皮素的損失。上述乙酸乙酯的用量及萃取次數，在確保槲皮素的萃取率的同時也減少了試劑的用量和濃縮干燥時的能量消耗，科學合理。

作為優選，乙醇浸泡步驟為：取干燥柚子皮粉碎，用65～80％的乙醇水溶液浸泡0.8～1.2h，柚子皮與乙醇水溶液的質量體積比為1g：1.2～2.5mL。上述乙醇水溶液的濃度及料液比科學合理，乙醇水溶液濃度過高，其他醇溶性雜質、色素、親脂性強的成分溶出量增加，影響槲皮素的提取效率。

作為優選，超聲提取步驟為：在45～60℃，60～100kHZ條件下將浸泡結束的柚子皮和乙醇水溶液混合物超聲提取25～35min，過濾取濾液，在25～35℃條件下旋轉蒸干溶劑，得到粗提物。將提取方式改為其他方式如回流提取或將提取劑改為其他試劑如甲醇，槲皮素的提取率遠沒有上述方案的提取率高，說明本發明的提取方式與提取試劑之間的互相作用顯著。上述提取溫度、超聲波頻率及超聲時間科學合理，槲皮素屬于多羥基類化合物，提高超聲溫度有利于槲皮素浸出，但溫度過高則影響槲皮素的穩定性，加速其被氧化破壞(槲皮素在高溫下發生降解、縮合、氧化等反應)。

作為優選，分離純化步驟為：利用柱層析和高效液相色譜分離純化乙酸乙酯萃取物得到槲皮素單體化合物，并以標準槲皮素為對照品，經過薄層色譜點板確定產品；薄層色譜的展開劑為石油醚：乙酸乙酯＝6:1。同樣的展開條件下，在紫外燈下觀察所測物質斑點與對照品在薄板上的斑點是否在同一位置(即斑點的Rf值是否與標樣一致)，就可確認所測物質中存在槲皮素或是槲皮素的相似物，最后通過紅外、核磁共振氫譜、核磁共振碳譜及高分辨質譜分析進一步的論證并確定槲皮素結構。