[發明專利]一種基于萘酰亞胺的β-葡萄糖醛酸苷酶的熒光探針及其應用

有效

• 申請號: 201710877084.0
• 申請日: 2017-09-25
• 公開（公告）號: CN107602643B
• 公開（公告）日: 2020-06-30
• 發明（設計）人: 王錚;崔京南;馮磊;崔文光;馬驍馳;田象閣
• 申請（專利權）人: 王錚;崔京南
• 主分類號: C07H17/02
• 分類號: C07H17/02;C09K11/06;G01N21/64;G01N33/573
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1.一種基于萘酰亞胺的β-葡萄糖醛酸苷酶的熒光探針的非診斷非治療目的的應用，其特征在于：該探針底物可被β-葡萄糖醛酸苷酶特異性催化，使探針底物中的葡糖醛酸苷鍵加水分解，探針為N-正丁基-4-O-β-D-葡萄糖醛酸-1,8-萘酰亞胺，其結構式如式（1）所示，

式（1）

該探針的應用為：采用N-正丁基-4-O-β-D-葡萄糖醛酸-1,8-萘酰亞胺作為β-葡萄糖醛酸苷酶的特異性底物，進行水解反應，通過定量檢測單位時間內的苷元產物的生成率來定量測定β-葡萄糖醛酸苷酶的活性；反應條件為：底物濃度介于1/10~10 Km之間；孵育體系pH為6.0；反應溫度介于20~60℃之間，底物消除率或產物的生成率低于20%；該探針底物的酶解產物具有熒光，酶解產物的檢測條件為激發波長450 nm，最大發射波長為556 nm。

2.根據權利要求1所述的一種基于萘酰亞胺的β-葡萄糖醛酸苷酶的熒光探針的非診斷非治療目的的應用，其特征在于：該探針底物還可用于β-葡萄糖醛酸苷酶抑制劑的快速篩選及抑制能力的定量評價：

（1）預先準備99 μL 體外代謝反應體系，包括pH 6.0的50 mM磷酸鹽緩沖液、0.1 mg/mL的β-葡萄糖醛酸苷酶，以及終濃度分別為50, 200, 600 μM的抑制劑洛哌丁胺、α-半乳糖、雙對硝基苯基磷酸酯、黃芩苷和表兒茶素沒食子酸酯于37℃條件下震蕩預孵3分鐘；

（2）向反應體系中加入1 μL濃度為1 mM的N-正丁基-4-O-β-D-葡萄糖醛酸-1,8-萘酰亞胺起始反應；

（3）60分鐘后，加入50 μL冰乙腈，劇烈震蕩后，終止反應；

（4）用高速冷凍離心機在4℃、20000×g的條件下，高速離心20分鐘后，取上清液，進行熒光檢測，Ex=450 nm，Em=556 nm；結果顯示，黃芩苷呈劑量依賴的抑制β-葡萄糖醛酸苷酶的催化反應。