[發(fā)明專利]一種黃原膠產(chǎn)量相關(guān)基因及其構(gòu)建高產(chǎn)黃原膠工程菌的應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201710874952.X
• 申請日: 2017-09-25
• 公開（公告）號: CN109554378B
• 公開（公告）日: 2022-09-13
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 余永紅;王海洪;馬建榮;遲海洋;黎壯偉
• 申請（專利權(quán)）人: 廣東食品藥品職業(yè)學(xué)院
• 主分類號: C12N15/54
• 分類號: C12N15/54;C12N15/74;C12N1/21;C12P19/06;C12R1/64
• 代理公司: 廣州粵高專利商標(biāo)代理有限公司 44102
• 代理人: 陳衛(wèi);禹小明

1.一種高產(chǎn)黃原膠的工程菌，其特征在于，是將野油菜黃單胞菌基因組中的基因XC_1672失活所得；所述野油菜黃單胞菌是指野油菜黃單胞菌的野生菌株Xcc8004；所述失活的方式是采用兩次同源重組的方式刪除基因XC_1672；所述基因XC_1672的基因序列如SEQ IDNO .1所示。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高產(chǎn)黃原膠的工程菌，其特征在于，由包括如下步驟的方法構(gòu)建得到：

S1、構(gòu)建基因敲除重組質(zhì)粒；

S2、將步驟S1獲得的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E .coli S17-1感受態(tài)細(xì)胞，獲得轉(zhuǎn)化子；

S3、采用接合轉(zhuǎn)移方式將重組質(zhì)粒導(dǎo)入至野油菜黃單胞菌Xcc8004中，獲得第一次同源重組菌；

S4、將步驟S3中得到的第一次同源重組菌株進(jìn)行第二次同源重組培養(yǎng)，利用復(fù)制平板法篩選第二次同源重組菌；

S5、PCR法驗(yàn)證步驟S4中得到的第二次同源重組菌，將擴(kuò)增片段測序，確認(rèn)需要敲除的基因已被刪除；

S6、將S5步驟中基因敲除成功的菌株進(jìn)行液體發(fā)酵培養(yǎng)，篩選獲得高產(chǎn)黃原膠的野油菜黃單胞菌工程菌。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的高產(chǎn)黃原膠的工程菌，其特征在于，所述的步驟S1為：以基因XC_1672的DNA序列為模板，設(shè)計(jì)上游引物對和下游引物對；所述的上游引物對包括上游正向引物P1-F1和上游反向引物P2-R1，分別為SEQ ID NO .3和SEQ ID NO .4所示；所述的下游引物對包括P3-F2和P4-R2，分別為SEQ ID NO .5和SEQ ID NO .6所示；采用PCR法分別擴(kuò)增上游片段和下游片段；將上游片段和下游片段酶切后連入自殺質(zhì)粒pK18mobsacB，獲得重組質(zhì)粒。

4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的高產(chǎn)黃原膠的工程菌，其特征在于，所述的步驟S3中第一次同源重組培養(yǎng)采用無抗性NYG固體培養(yǎng)基，30℃正置培養(yǎng)36h～48h。

5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的高產(chǎn)黃原膠的工程菌，其特征在于，所述的步驟S4中第二次同源重組培養(yǎng)采用無抗性NYG液體培養(yǎng)基，30℃下，200rpm振蕩培養(yǎng)10h～16h。