[發明專利]線粒體DNA檢測試劑在診斷奶牛脂肪肝的應用

有效

• 申請號: 201710871825.4
• 申請日: 2017-09-25
• 公開（公告）號: CN107475424B
• 公開（公告）日: 2021-02-05
• 發明（設計）人: 李心慰;劉國文;杜希良
• 申請（專利權）人: 吉林大學
• 主分類號: C12Q1/6883
• 分類號: C12Q1/6883;C12Q1/6806;C12N15/11
• 代理公司: 吉林長春新紀元專利代理有限責任公司 22100
• 代理人: 白冬冬

一種線粒體DNA檢測試劑在診斷奶牛脂肪肝的應用，屬于生物技術領域。本發明的目的是通過設計特異性引物，提供檢測奶牛全血中線粒體DNA的試劑用于制備奶牛脂肪肝血液學診斷的試劑盒。本發明設計了線粒體DNA的特異性引物和基因組DNA的特異性引物。本發明利用該試劑盒診斷脂肪肝簡單易行，對奶牛影響小，可大規模用于集約化奶牛場圍產期奶牛脂肪肝的篩查和早期預警。可以特異性的檢測奶牛全血中線粒體DNA含量，有效用于臨床奶牛脂肪肝的診斷。

技術領域

本發明屬于生物技術領域。

背景技術

圍產期（分娩前3周到分娩后3周的一段時間）奶牛經歷妊娠、分娩啟動泌乳等應激導致能量需求增加，而干物質攝入量減少，導致能量負平衡，進而引起機體的脂肪動員。脂肪組織中的甘油三酯發生水解，形成游離脂肪酸和甘油。游離脂肪酸釋放入血后，被肝臟大量攝取。肝臟攝取的脂肪酸有四個去向：經三羧酸循環完全氧化、不完全氧化生成酮體、合成甘油三酯并包裝成極低密度脂蛋白運輸出肝臟（反芻動物此功能有限）或合成甘油三酯并儲存在肝臟。當乙酰輔酶A的量不足以進行三羧酸循環時，游離脂肪酸便會沉積合成甘油三酯，而這正是脂肪肝綜合征的起始過程。我國奶牛脂肪肝的發病率在35%以上，高產奶牛高達48%，且有逐年上升的趨勢。脂肪肝會在不同程度上降低產奶產量和乳品質，此外還能損害生殖系統和免疫系統，導致免疫抑制，增加奶牛乳房炎和子宮內膜炎等感染性疾病的發病率。因此，脂肪肝一直以來被世界各國列為重要的奶牛疾病。

肝組織活檢技術是目前奶牛脂肪肝診斷的金指標。根據肝臟甘油三酯（TG）的含量（%濕重），可判斷脂肪肝的程度；肝臟中TG含量比上肝臟濕重，在1%-5%為輕度，5%-10%為中度，大于10%為重度。但肝組織活檢屬于介入性診斷技術，對奶牛產生的損傷和應激大，很難被奶牛場的管理者所接受，在很大程度上限制了其應用，尋找適合獸醫臨床需要的非介入性診斷方法和技術已成為奶牛脂肪肝研究的熱點。

發明內容

本發明的目的是通過設計特異性引物，提供檢測奶牛全血中線粒體DNA的試劑用于制備奶牛脂肪肝血液學診斷的試劑盒。

本發明特異性引物為：

線粒體DNA的特異性引物：

上游：5’- CGCGGTCATACGATTAACCC -3’；

下游：5’- AACCCTATTTGGTATGGTGCTT -3’；

基因組DNA的特異性引物：

上游：5’- GGTCCTGGCATCTTGTCCAT -3’；

下游：5’- TGGCAGTGCAAATGAAAAACTG -3’。

本發明特異性引物的制備方法：

設計特異性的qRT-PCR引物，在qRT-PCR反應中直接完成模板鏈的延長，引物設計原則：（1）引物長度一般為15-30個堿基；（2）引物的3’末端不互補；（3）引物分子內不互補；（4）G+C含量在40%-60%之間；（5）產物大小為70-300個堿基；通過NCBI查詢線粒體DNA的GenBank序號為：LC104807.1，設計的線粒體DNA的特異性引物； 通過NCBI查詢基因組DNA的NCBI Reference Sequence序號為：NM_178320.2；設計的基因組DNA的特異性引物。

本發明線粒體DNA特異性引物試劑盒：線粒體DNA的特異性引物、基因組DNA的特異性引物；熒光染料SYBR-GREEN。

本發明線粒體DNA引物試劑在診斷奶牛脂肪肝的應用。

本發明利用該試劑盒診斷脂肪肝簡單易行，對奶牛影響小，可大規模用于集約化奶牛場圍產期奶牛脂肪肝的篩查和早期預警。可以特異性的檢測奶牛全血中線粒體DNA含量，有效用于臨床奶牛脂肪肝的診斷。

具體實施方式