[發(fā)明專利]一種麥穗魚肝臟線粒體膜流動(dòng)性的活體測(cè)試方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710864369.0
• 申請(qǐng)日: 2017-09-22
• 公開（公告）號(hào): CN107449766B
• 公開（公告）日: 2018-07-27
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李會(huì)仙;吳豐昌;朱元榮
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國環(huán)境科學(xué)研究院
• 主分類號(hào): G01N21/64
• 分類號(hào): G01N21/64
• 代理公司: 北京精金石專利代理事務(wù)所(普通合伙) 11470
• 代理人: 劉曄

1.一種麥穗魚肝臟線粒體膜流動(dòng)性的活體測(cè)試方法，其特征在于，包括以下步驟：

S1.魚體暴露實(shí)驗(yàn)

麥穗魚體暴露實(shí)驗(yàn)采用水體染毒法：將麥穗魚室內(nèi)馴化10-16天，隨機(jī)暴露于藥液處理組的玻璃缸內(nèi)，進(jìn)行染毒暴露；

S2.麥穗魚活體肝臟線粒體膜的制備

取暴露時(shí)間終點(diǎn)的麥穗魚，解剖取其肝臟，在生理鹽水中清洗去除結(jié)締組織和脂肪組織，剪碎，加入冷蔗糖提取液，勻漿，過濾，勻漿液離心，取上清液，離心，棄上清液，用冷蔗糖提取液懸浮沉淀，再次離心，最后制得的線粒體沉淀用冷蔗糖提取液懸浮，即獲得肝臟線粒體懸浮液；

S3.DPH溶液的制備

DPH溶液為DPH濃度為2×10^-6M的四氫呋喃溶液；

S4.線粒體膜DPH熒光探針的標(biāo)記

在所述肝臟線粒體懸浮液中加入PBS緩沖液，加入DPH熒光探劑，在25℃下溫育30-40min即可；

S5.膜流動(dòng)性測(cè)定

膜流動(dòng)性的測(cè)定是通過熒光分光光度儀測(cè)定標(biāo)記的線粒體膜的熒光偏振度P的變化；用恒溫水浴控制測(cè)試體系的溫度；

按照以下公式計(jì)算熒光強(qiáng)度F和熒光偏振度P：

F＝I_Ⅱ+2I_I P＝I_Ⅱ-GI_I/I_Ⅱ+GI_I G：校正因子 G＝I_HV/I_HHI_HV

式中I_Ⅱ為起偏器和檢偏器光軸均在垂直方向時(shí)的熒光強(qiáng)度；

I_I起偏器光軸和檢偏器光軸分別在垂直方向和水平方向時(shí)的熒光強(qiáng)度；

I_HV為起偏器和檢偏器分別在水平和垂直方向時(shí)的熒光強(qiáng)度；

I_HH為起偏器和檢偏器均在水平方向時(shí)的熒光強(qiáng)度；

膜流動(dòng)性以1/P來表示，若膜的熒光偏振度P增大，則膜的流動(dòng)性降低，反之，則膜的流動(dòng)性增加；

其中，在步驟S4中，所述肝臟線粒體懸浮液中加入PBS緩沖液后，肝臟線粒體懸浮液中蛋白含量為125-160μg/ml；

在步驟S5中，所述熒光分光光度儀的激發(fā)光源波長設(shè)定為362nm，狹縫為10nm；發(fā)射波長設(shè)定為428nm，狹縫為10nm。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的活體測(cè)試方法，其特征在于，所述藥液12-24h更換為同濃度的藥液，以保持藥液濃度盡量維持不變。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的活體測(cè)試方法，其特征在于，所述麥穗魚體急性暴露實(shí)驗(yàn)期間不喂食，慢性暴露實(shí)驗(yàn)期間可喂食，需要及時(shí)清理未被食用完的飼料，并以加溶劑處理的麥穗魚作平行對(duì)照。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的活體測(cè)試方法，其特征在于，所述麥穗魚活體肝臟線粒體膜的制備的具體過程為：取暴露時(shí)間終點(diǎn)的麥穗魚，解剖取其肝臟，在0℃生理鹽水中清洗去除結(jié)締組織和脂肪組織，剪碎，加入8-12倍體積的冷蔗糖提取液，玻璃勻漿器冰浴勻漿，紗布過濾，勻漿液在2500-3500g離心10-15min，取上清液，再在10000-12000g離心25-35min，棄上清液，再次用8-12倍體積冷蔗糖提取液懸浮沉淀，10000-12000g離心25-35min，最后制得的線粒體沉淀用冷蔗糖提取液懸浮，即獲得肝臟線粒體懸浮液。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的活體測(cè)試方法，其特征在于，所述冷蔗糖提取液中，每1L冷蔗糖提取液中含有以下質(zhì)量的組分Tris 1.21g、EDTA0.0372g、蔗糖3.42g、NaCl 8g、BSA0.5％；保存于2-4℃條件下。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的活體測(cè)試方法，其特征在于，所述冷蔗糖提取液的pH為7.4。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的活體測(cè)試方法，其特征在于，所述麥穗魚活體肝臟線粒體膜的制備均在0-4℃下進(jìn)行。

8.根據(jù)權(quán)利要求1-7任一項(xiàng)所述的活體測(cè)試方法，其特征在于，所述DPH溶液配制的具體過程為：(1)以四氫呋喃作溶劑，配制DPH濃度為2×10^-3M的儲(chǔ)備液；(2)用PBS稀釋儲(chǔ)備液，猛烈振搖5-10min，得DPH濃度為2×10^-6M的DPH溶液，即DPH熒光探劑。