[發明專利]一種膽固醇氧化酶突變體及其制備方法與應用

在審

• 申請號: 201710863361.2
• 申請日: 2017-09-22
• 公開（公告）號: CN107746833A
• 公開（公告）日: 2018-03-02
• 發明（設計）人: 秦慧民;路福平;毛淑紅;朱張亮
• 申請（專利權）人: 天津科技大學
• 主分類號: C12N9/04
• 分類號: C12N9/04;C12P33/02;C12N15/70;C12N1/21
• 代理公司: 北京瑞盛銘杰知識產權代理事務所(普通合伙)11617
• 代理人: 郭曉迪

技術領域

本發明涉及一種膽固醇氧化酶突變體及其制備方法與應用，具體地說涉及通過反向PCR和定點突變技術定向改造構建的酶活力提高的膽固醇氧化酶突變體，屬于酶的基因工程技術領域。

背景技術

膽固醇氧化酶在生物新陳代謝扮演重要的角色，是影響底物分子攝取與跨膜轉運的關鍵因素，因此成為克服微生物底物轉化的瓶頸。它能將膽固醇氧化生成膽甾-4-烯-3-酮和H₂O₂，也可以作用于含有3β-羥基的甾體類化合物。膽固醇降解過程產生的中間產物可以作為甾體藥物合成的前體。而膽固醇氧化酶是膽固醇降解的第一步反應，且產物膽甾-4-烯-3-酮是一些固醇類激素藥物的前體，具有治療心血管疾病和抗肥胖等功效。人血漿中膽固醇水平過高會引起多種疾病和并發癥，危害人類健康。臨床上用膽固醇氧化酶作為檢測血清膽固醇含量的應用潛力巨大。此外，膽固醇氧化酶亦應用于去除食品中膽固醇，防治鱗翅目害蟲的生物農藥。高比活、高催化效率是幾乎所有工業用途對膽固醇氧化酶的要求，而這類膽固醇氧化酶的工程菌株的獲得主要通過誘變、篩選和酶分子改良獲得。

發明內容

本發明的目的是針對現有膽固醇氧化酶存在熱穩定性差、催化效率低等問題，提供一種通過定向改造構建的酶活力提高的膽固醇氧化酶突變體、制備方法與應用。本發明以簡單脂肪桿菌(Pimelobacter simplex)TCCC11037基因組為模板克隆出膽固醇氧化酶PsCO基因，構建重組菌株，通過反向PCR和定點突變技術獲得酶活力提高的膽固醇氧化酶突變體。本發明提供的膽固醇氧化酶突變體的比酶活有較大幅度提高，為今后生物酶法高效催化生產甾體藥物提供了理論依據與技術保障，并且也為膽固醇氧化酶在臨床上用于膽固醇的檢測提供新的思路。

在本發明中采用如下定義：

1、氨基酸和DNA核酸序列的命名法

使用氨基酸殘基的公認IUPAC命名法，用單個字母或三字母代碼形式。DNA核酸序列采用公認IUPAC命名法。

2、膽固醇氧化酶突變體的標識

采用“原始氨基酸位置替換的氨基酸”來表示膽固醇氧化酶突變體中突變的氨基酸。如Phe70Leu或F70L，表示位置70的氨基酸由親本膽固醇氧化酶的苯丙氨酸Phe替換成亮氨酸Leu，位置的編號對應于SEQ ID NO：1中膽固醇氧化酶的氨基酸序列編號。

本發明的技術方案概述如下：

通過定向改造構建的酶活力提高的膽固醇氧化酶突變體，由親本野生型簡單脂肪桿菌(Pimelobacter simplex)膽固醇氧化酶PsCO進行定向進化，通過密碼子優化、反向PCR和定點突變技術，獲得膽固醇氧化酶突變體F70L(氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示)，親本簡單脂肪桿菌膽固醇氧化酶氨基酸序列SEQ ID NO：1中在氨基酸取代位置突變，采用“原始氨基酸位置替換的氨基酸”來表示膽固醇氧化酶突變體中突變的氨基酸，所述膽固醇氧化酶突變體為：

用于表達所述的膽固醇氧化酶及其突變體的表達載體為pET28a；用于所述的表達載體轉化的微生物宿主細胞為大腸桿菌BL21(DE3)。

本發明膽固醇氧化酶突變體的制備步驟概述如下：

1、以野生型簡單脂肪桿菌TCCC11037的基因組為模板，設計引物，通過PCR技術擴增膽固醇氧化酶PsCO基因(序列如SEQ ID No.3所示)，通過密碼子優化后(序列如SEQ ID No.4所示)構建于pET28a質粒上，獲得重組表達載體PsCO-pET28a。

2、以野生型重組載體PsCO-pET28a為模板，通過反向PCR和定點突變技術，將野生型氨基酸序列SEQ ID NO：1第70位的苯丙氨酸Phe突變為亮氨酸Leu，得到突變體F70L，突變體氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3、將突變體重組載體通過化轉轉入大腸桿菌BL21(DE3)，構建得到重組工程菌BL21(DE3)/F70L。

4、膽固醇氧化酶突變體的蛋白表達純化：將獲得的重組工程菌轉接培養，以終溶度為0.5mM的IPTG為誘導劑，在16℃，160r/min下使膽固醇氧化酶大量可溶性表達。

5、酶活測定：低溫收集菌體，超聲破碎細胞，高速離心得到上清即含有膽固醇氧化酶突變體。高速離心上清經Ni-NTA親和層析分離純化后，得到膽固醇氧化酶突變體，通過SDS-PAGE鑒定蛋白大小及純化效果，經超濾濃縮，測定蛋白濃度及酶學性質。

本發明的有益效果如下：