[發(fā)明專利]基于金屬螯合親和層析制備口蹄疫病毒疫苗抗原的方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201710861343.0
• 申請日: 2017-09-21
• 公開（公告）號: CN109535230A
• 公開（公告）日: 2019-03-29
• 發(fā)明（設計）人: 張松平;蘇志國;林旋;楊延麗;馬光輝
• 申請（專利權）人: 中國科學院過程工程研究所
• 主分類號: C07K14/09
• 分類號: C07K14/09;C07K1/36;C07K1/22;C07K1/18;C07K1/20;C07K1/30
• 代理公司: 中科專利商標代理有限責任公司 11021
• 代理人: 任巖

1.一種基于金屬螯合親和層析制備口蹄疫病毒疫苗抗原的方法，包括如下步驟：

(1)將滅活后的口蹄疫病毒細胞培養(yǎng)液進行固液分離后，取上清；

(2)將獲得的上清進行金屬螯合層析，收集洗脫液組分，獲得滅活口蹄疫抗原。

2.根據(jù)權利要求1所述的方法，其中，所述的滅活口蹄疫病毒抗原選自A型、O型、C型、SAT1型、SAT2型、SAT3型和Asia1型中的任一種，優(yōu)選A型或O型。

3.根據(jù)權利要求1所述的方法，其中，所述固液分離的方法如下：將滅活后的口蹄疫病毒細胞培養(yǎng)液在4℃下以8000-9000rpm的轉速離心25分鐘后棄去沉淀，保留上清。

4.根據(jù)權利要求1所述的方法，其中，在所述的固液分離之后，在所述的將獲得的上清進行金屬螯合層析之前，還對獲得的上清進行粗分離處理，獲得粗分離組分；所述粗分離處理的方法優(yōu)選離子交換層析、疏水層析或PEG沉淀。

5.根據(jù)權利要求1所述的方法，其中所述金屬螯合層析的方法如下：

先將金屬螯合層析柱用平衡緩沖液平衡3-5個柱體積，將步驟(1)獲得的上清進樣到平衡好的層析柱中，層析過程使用280nm和259nm紫外吸收波長進行蛋白檢測，進樣的體積為0.5-30倍層析柱體積，優(yōu)選10-20倍層析柱體積；待進樣完后，用平衡緩沖液淋洗層析柱3-5個CV；用含有咪唑的洗脫緩沖液進行洗脫，收集洗脫組分，從而獲得高純度的滅活口蹄疫病毒抗原。

6.根據(jù)權利要求5所述的方法，其中，在將步驟(1)獲得的上清進樣到平衡好的層析柱中的操作中，若在所述的固液分離之后，在所述的將獲得的上清進行金屬螯合層析之前，還對獲得的上清進行粗分離處理，獲得粗分離組分，則以獲得的粗分離組分進樣。

7.根據(jù)權利要求1所述的方法，其中，所述金屬螯合層析中，使用的金屬離子配基為Cu²⁺、Co²⁺、Ni²⁺或Zn²⁺，優(yōu)選Cu²⁺、Ni²⁺或Zn²⁺，最優(yōu)選Ni²⁺。

8.根據(jù)權利要求1所述的方法，其中，所述金屬螯合層析中，平衡緩沖液系統(tǒng)為磷酸鹽緩沖液、三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液或檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液，優(yōu)選磷酸鹽緩沖液；平衡緩沖液的濃度為0mM-150mM，pH為6.0-9.0，優(yōu)選濃度10mM～50mM，pH為7.0-8.0；平衡緩沖液含氯化鈉濃度為0M-500mM，優(yōu)選0M-200mM，含咪唑濃度為0mM-20mM，優(yōu)選0mM-10mM。

9.根據(jù)權利要求1所述的方法，其中，所述金屬螯合層析中，洗脫緩沖液為磷酸鹽緩沖液、三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液、檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液或檸檬酸鹽緩沖液，優(yōu)選磷酸鹽緩沖液或檸檬酸鹽緩沖液；洗脫緩沖液的濃度為10mM-150mM，優(yōu)選濃度10mM～50mM；pH為4.0-9.0，進行咪唑梯度洗脫時，pH優(yōu)選7.0-8.0。

10.根據(jù)權利要求1所述的方法，其中，所述金屬螯合層析中，洗脫方式為咪唑階梯梯度洗脫或咪唑線性梯度洗脫；

其中，咪唑階梯梯度洗脫的洗脫方法為：依次用含咪唑濃度為10mM、100mM、200mM、300mM、500mM、1000mM的洗脫緩沖液進行洗脫，收集含有口蹄疫抗原的洗脫組分；

咪唑線性梯度洗脫方法為：依次用平衡緩沖液和含咪唑濃度為1M的洗脫緩沖液進行線性梯度洗脫，洗脫15-25個柱體積，收集含有口蹄疫抗原的洗脫組分。

11.由權利要求1～10任一項所述的方法制備得到的口蹄疫病毒疫苗抗原。