[發明專利]一種伊維菌素偶聯的Bt殺蟲毒素及其應用

有效

• 申請號: 201710859935.9
• 申請日: 2017-09-21
• 公開（公告）號: CN107417774B
• 公開（公告）日: 2021-04-09
• 發明（設計）人: 朱育菁;潘志針;劉波;許煉;陳崢;張靜;傅南雁
• 申請（專利權）人: 福建省農業科學院農業生物資源研究所
• 主分類號: C07K14/325
• 分類號: C07K14/325;C07K1/107;A01N63/50;A01P7/04
• 代理公司: 福州市鼓樓區京華專利事務所(普通合伙) 35212
• 代理人: 王美花

1. 一種伊維菌素偶聯的Bt殺蟲毒素，其特征在于：其制備方法的具體操作步驟如下：按1:1.5:1.5的摩爾比分別稱取4’’-O- succinoyl伊維菌素、EDC和NHS，且溶于DMSO溶劑內，以對4’’-O- succinoyl伊維菌素的羧基進行活化，得活化后的4’’-O- succinoyl伊維菌素，待用；取Bt Cry2Ab殺蟲蛋白配置含5 mmol /L Bt Cry2Ab殺蟲蛋白的Na₂CO₃/ NaHCO₃緩沖液，即Bt Cry2Ab殺蟲蛋白溶液，待用；分別量取配制好的活化后的4’’-O- succinoyl伊維菌素與所述Bt Cry2Ab殺蟲蛋白溶液，攪拌1小時進行偶聯反應，獲得Bt殺蟲毒素；所述4’’-O- succinoyl伊維菌素制備過程為：按摩爾比1:3:6稱取伊維菌素、叔丁基二甲基氯硅烷和咪唑，并溶解于四氫呋喃，于室溫下攪拌反應2小時，從而對伊維菌素的5-OH進行保護；取保護后的伊維菌素溶解于二氯甲烷中，并加入4-二甲氨基吡啶、三乙胺和琥珀酸酐，且保護后的伊維菌素、4-二甲氨基吡啶、三乙胺、琥珀酸酐的摩爾比為1:4:8:16，之后避光水浴回流3小時，以對伊維菌素4’’-OH進行羧基化改造，接著用乙醚萃取產物，柱層析分離產物；然后取層析分離后的伊維菌素溶解于甲醇中，并加入對甲苯磺酸，且層析分離后的伊維菌素與對甲苯磺酸的摩爾比為1:6，室溫攪拌反應30分鐘進行脫保護，再采用乙酸乙酯萃取產物，最后薄層色譜分離即得4’’-O- succinoyl 伊維菌素。

2.根據權利要求1所述的一種伊維菌素偶聯的Bt殺蟲毒素，其特征在于：所述BtCry2Ab殺蟲蛋白的制備步驟如下：

（1）將cry2Ab基因通過熱擊法轉化至大腸桿菌工程菌以獲得含有cry2Ab基因的大腸桿菌工程菌，之后將其接種至LB固體培養基上，將LB固體培養基置于30℃下恒溫培養24h進行菌種活化；

（2）將活化后的大腸桿菌工程菌菌種接種于LB液體培養基中，并置于搖瓶中37℃發酵培養，轉速設定為180 r/min，待菌液OD₆₀₀到達0.5后，將溫度調整為25℃，180 r/min繼續培養24h；接著將發酵培養所得發酵液置于4℃、10000 r/min 條件下離心 10min，離心結束后取沉淀重懸于Na₂CO₃ 裂解液，于4℃下超聲裂解30 min，裂解后的溶液4℃、10000 r/min離心30 min，取上清液；

（3）將步驟（2）所得上清液過IDA-Ni親和層析柱，并先采用Ni50緩沖液除去雜蛋白，后采用Ni500緩沖液洗脫目的蛋白；所述Ni50緩沖液的配方為NaCl 300mM、NaH₂PO₄ 50mM、咪唑50mM；Ni500緩沖液的配方為NaCl 300mM、 NaH₂PO₄ 50mM、咪唑 500mM；洗脫所得目的蛋白經脫鹽柱PD-10脫鹽則得到Bt Cry2Ab殺蟲蛋白，將Bt Cry2Ab殺蟲蛋白置于-20℃下保存，備用。

3.一種權利要求1所述伊維菌素偶聯的Bt殺蟲毒素的應用，其特征在于：所述Bt殺蟲毒素作為農業殺蟲劑的應用。