[發(fā)明專利]一組特異識別三種海洋毒素的核酸適配體

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201710859591.1
• 申請日: 2017-09-21
• 公開（公告）號: CN107541516B
• 公開（公告）日: 2020-07-28
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 王周平;顧華杰;段諾;吳世嘉;葉華;馬鵬飛;鄒穎
• 申請（專利權(quán)）人: 江南大學
• 主分類號: C12N15/115
• 分類號: C12N15/115;C12N15/10
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發(fā)明提供了一組能同時識別軟骨藻酸和河豚毒素的單鏈DNA核酸適配體DA?01和TTX?27，一條能特異性識別軟骨藻酸的單鏈DNA核酸適配體DA?06，一條能特異性識別河豚毒素的單鏈DNA核酸適配體TTX?07，一條能特異性識別石房蛤毒素的單鏈DNA核酸適配體STX?41。本發(fā)明采用磁性還原氧化石墨烯(MRGO)輔助分離的指數(shù)富集配體系統(tǒng)進化(SELEX)技術(shù)，利用磁性還原氧化石墨烯能吸附游離的單鏈DNA但不能吸附與靶標分子結(jié)合的單鏈DNA的特性，同時利用其磁分離富集特性，將對靶標毒素具有親和性的和無親和性的單鏈DNA分離，經(jīng)過16輪反復的孵育、分離、擴增、制備單鏈的體外篩選，對所得ssDNA進行一級結(jié)構(gòu)同源性和二級結(jié)構(gòu)相似性分析，然后測定其親和性和特異性，最終獲得一組高親和性和特異性的核酸適配體。該組適配體在水產(chǎn)品中軟骨藻酸、河豚毒素、石房蛤毒素的分析檢測和分離富集脫除凈化方面具有廣泛的應(yīng)用前景。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于食品安全生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及利用磁性還原氧化石墨烯輔助分離的指數(shù)富集配體系統(tǒng)進化技術(shù)篩選一組能同時識別軟骨藻酸和河豚毒素的單鏈DNA核酸適配體及能特異性識別軟骨藻酸、河豚毒素、石房蛤毒素的單鏈DNA核酸適配體各一條。

背景技術(shù)

海洋毒素主要來自有毒藻類，經(jīng)食物鏈傳遞給水生動物并在其體內(nèi)積累。近年來，隨著海洋赤潮和湖泊藍藻爆發(fā)的加劇，人們因食用含毒水產(chǎn)品造成的食物中毒事件逐漸增多。海洋毒素種類繁多，根據(jù)其溶解性不同可以分為親水性和親脂性兩大類。石房蛤毒素(Saxitoxin,STX)、軟骨藻酸(Domoic acid,DA)和河豚毒素(Tetrodotoxin,TTX)是最主要的三類親水性海洋毒素。STX和TTX都是鈉離子通道抑制劑，能通過選擇性地結(jié)合電壓門控鈉離子通道表面受體阻止鈉離子的傳輸，進而阻斷神經(jīng)沖動的傳導，從而引起神經(jīng)麻痹、呼吸困難等癥狀，甚至造成死亡。軟骨藻酸是一種類氨基酸的興奮性神經(jīng)毒素，與中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的丙酸受體、谷氨酸受體、天冬氨酸受體都具有很強的親和力，通過激活這些受體引起Ca²⁺、Na⁺在神經(jīng)細胞中的過量積累并產(chǎn)生活性氧，進而對神經(jīng)系統(tǒng)造成損害，表現(xiàn)出失憶、方向感迷失、癲癇、昏迷等癥狀。這些毒素不僅會對人們的健康和安全造成危害，也會影響水產(chǎn)品行業(yè)，破壞生態(tài)環(huán)境。因此，快速、準確地檢測水產(chǎn)品或水體中的毒素顯得尤為重要。

小鼠生物測試法是應(yīng)用最廣泛的海洋毒素檢測方法，也是很多國家的法定檢測方法，可以通過癥狀觀察和致死率計算進行直觀的毒性分析。然而，這種方法分析周期較長，重復性很差，且無法區(qū)分不同的毒素并對其精確定量，其最大的缺陷還在于實驗倫理問題。鑒于此，歐盟、日本、中國等都開始采用依賴于儀器的化學分析法代替小鼠生物法作為毒素的標準檢測方法。化學分析法主要采用氣相色譜、液相色譜、毛細管電泳結(jié)合熒光法、質(zhì)譜法等對各類毒素進行分辨和定量。這類方法一直是人們研究的熱點，已衍生出了眾多新型的方法，精確度非常高，且可進行多組分同時檢測和高通量分析。但是，化學分析法也具有儀器設(shè)備昂貴，需要專業(yè)操作分析人員，樣品前處理復雜等缺點，并且也不適應(yīng)目前越來越重要的現(xiàn)場快速檢測。免疫檢測法是基于抗原-抗體的特異性識別，結(jié)合比色、熒光、化學發(fā)光、電化學、石英晶體微天平、表面等離子共振等技術(shù)構(gòu)建的新型快速檢測技術(shù)。免疫法操作簡便，基于酶聯(lián)免疫吸附法已開發(fā)出了眾多商品化的試劑盒，而膠體金試紙條更是適用于現(xiàn)場檢測。但是，抗體的制備復雜、耗時，特別是對于小分子的海洋毒素，其免疫原性較低甚至無免疫原性，而其毒性卻對實驗動物和細胞有害。制備得到的抗體不易長期保存，交叉反應(yīng)也是其難以避免的缺點。