[發(fā)明專利]一種用于Small RNA的測序方法、測序試劑和應用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201710855713.X
• 申請日: 2017-09-20
• 公開（公告）號: CN109536594B
• 公開（公告）日: 2022-11-01
• 發(fā)明（設計）人: 李計廣;馬可心;趙芳;邱敏;韋小芳;馮太青;龍小娟;齊曉娟;王靜靜;劉二凱;陳奧;徐崇鈞;章文蔚
• 申請（專利權(quán)）人: 深圳華大智造科技股份有限公司
• 主分類號: C12Q1/6869
• 分類號: C12Q1/6869
• 代理公司: 深圳鼎合誠知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 44281
• 代理人: 彭家恩;羅瑤

本申請公開了一種用于Small RNA的測序方法、測序試劑和應用。本申請用于Small RNA的測序方法，包括在對混合樣本的環(huán)狀文庫進行測序時，向引物溶液中添加正常測序引物和阻斷測序引物，采用混合引物進行測序；阻斷測序引物由正常測序引物3’末端羥基經(jīng)化學修飾而成。本申請的測序方法，通過添加阻斷測序引物，使得混合樣本環(huán)狀文庫Small RNA測序得以實現(xiàn)，并能有效的保障標簽序列的測序，進而提高了數(shù)據(jù)利用率，得到良好的拆分率。本申請的Small RNA測序方法和測序試劑，為Small RNA混合樣本測序提供了一種新的思路和方案，解決了目前的環(huán)狀文庫Small RNA測序的測序資源浪費等問題。

技術(shù)領(lǐng)域

本申請涉及基因測序領(lǐng)域，特別是涉及一種用于Small RNA的測序方法、測序試劑和應用。

背景技術(shù)

Small RNA，包括micro RNAs、siRNAs和pi RNAs，是一大類調(diào)控分子，幾乎存在于所有的生物體中，是生命活動重要的調(diào)控因子，在基因表達調(diào)控、生物個體發(fā)育、代謝和疾病的發(fā)生等生理過程中都起著重要的作用。通過對Small RNA大規(guī)模測序分析，可以從中獲得物種全基因組水平的Small RNA圖譜，實現(xiàn)包括新Small RNA分子的挖掘，Small RNA作用靶基因的預測和鑒定、樣品間差異表達分析、Small RNA聚類和表達譜分析等科學應用。Small RNA通過多種多樣的作用途徑，包括mRNA降解、翻譯抑制、異染色質(zhì)形成以及DNA去除等，來調(diào)控生物體的生長發(fā)育和疾病發(fā)生，因此Small RNA具有很高的科研價值，研究學者非常熱衷Small RNA的相關(guān)研究，于是對Small RNA的測序就變成高度關(guān)注的熱點。

目前各個測序平臺測序Small RNA的方法，一種是通過鏈狀的文庫進行測序的，一種是進行環(huán)狀文庫測序的。其中，環(huán)狀文庫測序是將Small RNA進行環(huán)化，形成環(huán)狀文庫；再以環(huán)狀文庫為模板生成DNA納米球，此DNA納米球是多拷貝的鏈狀待測鏈，每一個拷貝均和環(huán)狀文庫互補；對這個多拷貝的鏈狀待測鏈進行測序，以獲得目標區(qū)域的序列。環(huán)狀文庫Small RNA測序存在一個重要的缺陷就是，當多個樣本混合測序時，通常會對不同樣本添加不同的標簽序列，由于Small RNA本身的小片段性，僅有18-30nt，為了獲得更多的數(shù)據(jù)，通常將測序讀長設置為50循環(huán)；這使得進行目標片段區(qū)域測序時，大部分標簽序列包括其引物區(qū)域，會被測序目標片段的新生成鏈覆蓋，導致再進行標簽序列測序時，無法結(jié)合上標簽序列的引物，即不能完成標簽序列的測序；這會導致兩個很嚴重的問題，第一，因為不能完成標簽序列的測序，無法區(qū)分不同的樣本，所以這些數(shù)據(jù)將會被過濾棄掉，即大部分數(shù)據(jù)都是不可用數(shù)據(jù)，對測序資源造成極大浪費；第二，因為大部分數(shù)據(jù)都是不可用數(shù)據(jù)，導致不能獲得較好的拆分率。

因為以上問題和缺陷，目前的環(huán)狀文庫Small RNA測序，如果想獲得較多的數(shù)據(jù)，每次只能測序一個樣本，不能多個樣本混合同時進行測序。而目前的測序平臺通常都具有高通量測序的能力，每次卻只測序一個樣本，這也會造成測序資源的極大浪費。

發(fā)明內(nèi)容

本申請的目的是提供一種改進的用于Small RNA的測序方法，以及該測序方法采用的測序試劑，及其應用。

本申請采用了以下技術(shù)方案：

本申請的一方面公開了一種用于Small RNA的測序方法，包括在對混合樣本的環(huán)狀文庫進行測序時，向引物溶液中添加正常測序引物和阻斷測序引物，組成混合引物，采用混合引物進行測序；其中，阻斷測序引物由正常測序引物的3’末端的羥基經(jīng)過化學修飾而成。