[發明專利]基于智能恒溫擴增技術檢測副溶血弧菌的引物組、試劑盒及方法

在審

• 申請號: 201710853352.5
• 申請日: 2017-09-20
• 公開（公告）號: CN107641659A
• 公開（公告）日: 2018-01-30
• 發明（設計）人: 葉蕾;石磊;閆鶴;陳洵;常彥磊
• 申請（專利權）人: 暨南大學
• 主分類號: C12Q1/689
• 分類號: C12Q1/689;C12Q1/6844;C12Q1/04;C12N15/11
• 代理公司: 廣州三環專利商標代理有限公司44202
• 代理人: 王會龍

1.一種基于智能恒溫擴增技術檢測副溶血弧菌的引物組，包括TP引物、FP引物、BP引物、OP1引物和OP2引物，其核苷酸序列分別如下所示:

FP引物：TTTATATATATATAAATCCGCTCTACAACTGG

TP引物：CTGGGCAGTTGTTAGCGCGATGTATTGGTC

BP引物：CGGCGCGGCTGGTG

OP1引物：TTGCCAAAGCGAAGAACC

OP2引物：ACTTGATCACCAACCCCT。

2.如權利要求1所述的基于智能恒溫擴增技術檢測副溶血弧菌的引物組，其特征在于：擴增反應時，TP引物、FP引物、BP引物、OP1引物和OP2引物的摩爾比為：8：8：4：1：1。

3.一種基于智能恒溫擴增技術檢測副溶血弧菌的試劑盒，其特征在于，該檢測試劑盒中含有如權利要求1或2所述的智能恒溫擴增引物組。

4.根據權利要求3所述的基于智能恒溫擴增技術檢測副溶血弧菌的試劑盒，其特征在于，還包括以下成分的部分或者全部：(1)DNA聚合酶；(2)錯配結合蛋白；(3)智能恒溫擴增反應液；(4)熒光顯色劑；(5)陽性對照和陰性對照。

5.根據權利要求4所述的基于智能恒溫擴增技術檢測副溶血弧菌的試劑盒，其特征在于：所述DNA聚合酶為Bst DNA聚合酶；所述錯配結合蛋白為Tap Muts錯配結合蛋白。

6.根據權利要求4所述的基于智能恒溫擴增技術檢測副溶血弧菌的試劑盒，其特征在于：所述智能恒溫擴增反應液含有：28mM dNTPs、10％DMSO、40mM Tris-HCl(pH8.8)、20mM KCl、20mM(NH4)2SO4、16mM MgSO4，0.2％20。

7.根據權利要求4所述的基于智能恒溫擴增技術檢測副溶血弧菌的試劑盒，其特征在于：陽性對照為含有副溶血弧菌tlh/ldh基因片段的T載體克隆，陰性對照為不含副溶血弧菌tlh/ldh基因片段的水或其他溶劑。

8.根據權利要求4所述的基于智能恒溫擴增技術檢測副溶血弧菌的試劑盒，其特征在于：所述熒光顯色劑為1/50000原液稀釋的Green I。

9.一種基于智能恒溫擴增技術檢測副溶血弧菌的方法，包括如下步驟：

(1)待檢樣品DNA的提?。?/p>

(2)智能恒溫擴增反應：將步驟(1)中提取的待檢樣品DNA加入智能恒溫擴增反應體系中，混勻后離心，并于60-65℃反應20-40min；該智能恒溫擴增反應體系中含有如權利要求1或2所述的智能恒溫擴增引物組；

(3)結果判斷：通過觀察ESE-tubescanner擴增儀的擴增曲線判斷擴增結果。

10.根據權利要求9所述的基于智能恒溫擴增技術檢測副溶血弧菌的方法，其特征在于，所用智能恒溫擴增反應的體系為：25μL反應體系中含有TP和EP引物各1.6μmol/L、BP引物0.8μmol/L、OP1和OP2引物各0.5μmol/L、dNTP 0.5mmol/L、甜菜堿0.6mol/L、(NH4)2SO4mmol/L、MgCl2 2.5mmol/L、KCl 10mmol/L、MgSO4 2mmol/L、Green I 0.5μL、pH為8.8的Tris-HCl 20mmol/L、0.2％20、6U Bst DNA聚合酶、1μg Tap Muts、1μL步驟(1)中提取的待檢樣品DNA，用去離子水補齊到25μL。