[發明專利]葉酸檢測試劑盒及其制備方法

在審

• 申請號: 201710852510.5
• 申請日: 2017-09-19
• 公開（公告）號: CN107703315A
• 公開（公告）日: 2018-02-16
• 發明（設計）人: 于鴻翔;劉衍亮;宋璐琳;王文亮;汪玉婷
• 申請（專利權）人: 威海紐普生物技術有限公司
• 主分類號: G01N33/82
• 分類號: G01N33/82;G01N33/558;G01N33/543
• 代理公司: 威海科星專利事務所37202
• 代理人: 初姣姣

1.一種葉酸檢測試劑盒，設有試紙卡，其特征在于所述試紙卡設有由下自上依次設有：PVC板、樣品墊、結合墊、硝酸纖維素膜和吸水墊，其中結合墊上吸附有稀土熒光微球標記的葉酸單克隆抗體，所述稀土熒光微球的直徑為60-120nm，稀土熒光微球摻雜稀土鑭系元素，在基態下穩定，在340-380nm的激發光源作用下發射出波長范圍在540-600nm的熒光；所述單克隆抗體為純化后混合的單克隆抗體，來源于針對2-6個不同的葉酸抗原表位的單克隆抗體細胞株。

2.根據權利要求1所述的一種葉酸檢測試劑盒，其特征在于所述結合墊的稀土熒光微球的直徑優選是90-110nm；所述稀土熒光微球摻雜有稀土鑭系元素。

3.根據權利要求2所述的一種葉酸檢測試劑盒，其特征在于所述稀土熒光微球摻雜稀土絡合物；結合墊上稀土熒光微球標記的抗體來源于針對3個不同抗原表位的單克隆細胞細胞株。

4.根據權利要求1所述的一種葉酸質檢測試劑盒，其特征在于所述結合墊采用如下步驟制得：將玻璃纖維膜浸泡于200mM Tris-HCL處理液中，4℃浸泡4小時，然后取出37℃烘箱烘干4小時，備用，將玻璃纖維膜在Bio-DotXYZ3050三維噴點平臺上，用Bio-Jet Quanti300非接觸式微定量噴頭將稀土熒光微球標記的葉酸單克隆抗體噴到玻璃纖維膜，37℃烘干2小時后制得。

5.根據權利要求4所述的一種葉酸質檢測試劑盒，其特征在于結合墊上的所述稀土熒光微球標記的葉酸單克隆抗體采用如下步驟制得：

步驟1：單克隆抗體細胞株的獲得：參照葉酸氨基酸序列，選擇抗原性強的位點人工合成20個氨基酸左右的多肽序列，交聯到KLH上，采用標準的單克隆抗體制備方法制備特異性高親和力的單克隆抗體細胞株，將所獲得的細胞株對應的單克隆抗體進行配對實驗和親和力測定實驗，根據實驗結果確定捕獲抗體和檢測抗體；

步驟2：單克隆抗體的制備：采用標準的腹水生產工藝制備并純化用于檢測的葉酸單克隆抗體，分裝后保存于-20℃備用；

步驟3：稀土熒光微球的醛基化：取3mg稀土熒光微球，用50mM，pH9.5的碳酸鹽緩沖液，采用離心法洗滌3遍，離心速度為12000rpm，時間為5分鐘，最后重懸于100μl的上述碳酸鹽緩沖液中，加入300μl醛基化的葡聚糖，混勻，室溫下暗反應4小時，采用同樣的離心法洗滌和重懸到100μl的上述碳酸鹽緩沖液中，置于4℃備用；

步驟4：稀土熒光微球標記的葉酸單克隆抗體的制備：將2mg用于檢測的葉酸單克隆抗體用上述碳酸鹽緩沖液于4℃透析過夜，然后與上述醛基化的稀土熒光微球混合，4℃反應過夜；然后，加入硼氫化鈉至終濃度10mM，4℃反應4小時；再加入等體積的封閉液(100mM Tris-HCL，pH7.5，含2％BSA，5％蔗糖)，4℃封閉過夜；然后用100mM Tris-HCL，pH7.5的緩沖液采用離心法洗滌3遍，重懸于100μl的100mM Tris-HCL緩沖液中，4℃避光保存備用。

6.根據權利要求1所述的一種葉酸質檢測試劑盒，其特征在于所述包被有檢測線和質控線的硝酸纖維素膜通過以下步驟制得：

步驟1：根據前述配對實驗和親和力測定實驗，選擇用于捕獲的抗體對應的單克隆抗體細胞株，按照標準的腹水生產工藝制備并純化用于捕獲的葉酸單克隆抗體，保存于-20℃備用；

步驟2：分別用包被稀釋液將葉酸單克隆抗體和羊抗小鼠IgG抗體調整濃度到1-5mg/ml，膜液量為1-2μl/cm，將它們分別作為檢測線和質控線平行噴灑于硝酸纖維素膜上進行包被，檢測線和質控線間隔為3-7mm，然后置于烘箱中，37℃烘干2小時。

7.根據權利要求1所述的一種葉酸質檢測試劑盒，其特征在于所述樣品墊通過以下步驟制得：將玻璃纖維膜浸泡于含有2.0％Triton X-100，2％BSA，0.1M Tris緩沖液，pH7.5的處理液中，于4℃浸泡4個小時，然后置于烘箱中，37℃烘干2小時。