[發明專利]一種豬瘟病毒Erns蛋白的抗原表位、抗體的制備及應用

在審

• 申請號: 201710850113.4
• 申請日: 2017-09-19
• 公開（公告）號: CN107739402A
• 公開（公告）日: 2018-02-27
• 發明（設計）人: 童光志;李國新;徐晶晶;武吉強;姜一峰;高飛;童武;鄭浩
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院上海獸醫研究所
• 主分類號: C07K14/18
• 分類號: C07K14/18;C07K16/10;G01N33/68;G01N33/569
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明屬于生物技術領域。更具體涉及一種豬瘟病毒Erns蛋白的抗原表位、抗體的制備及應用。

背景技術

CSF是由CSFV引起的豬的一種高度接觸性傳染病，給養豬業造成嚴重的經濟損失。CSFV屬于黃病毒科、瘟病毒屬成員之一。CSFV是有囊膜的單股正鏈RNA病毒，基因組大小約12.3kb，僅含有一個大的開放性閱讀框架(ORF)。此ORF翻譯成含3898個氨基酸殘基，分子量約438kDa的多聚蛋白，并進一步在病毒和宿主細胞蛋白酶的作用下加工成結構蛋白和非結構蛋白，其結構蛋白和非結構蛋白在病毒RNA上的編碼順序為Npro、C、Erns(E0)、E1、E2、P7、NS2-3、NS4A、NS4B、NS5A、NS5B。其中，除C、Erns、E1和E2為結構蛋白外.其余均為非結構蛋白。

Erns，是病毒的一種囊膜糖蛋白，也稱gp44/48，舊稱E0。有9個可能的糖基化位點，去糖基的蛋白骨架分子量約26KDa，由病毒ORF中Glu268-Ala494組成。在感染細胞中Erns在內質網內積累，并可存在于細胞膜表面或被分泌到胞外。在病毒粒子中Erns以97KDa的同源二聚體形式存在于囊膜表面。由于其分子內缺乏疏水的膜錨定區，與病毒囊膜結合力弱，易從囊膜上游離下來。Erns可誘導產生豬瘟的中和抗體，免疫豬可誘導產生對致死量CSFV的保護性免疫。由于編碼Erns的核酸序列在屬內比編碼E2的序列保守程度高，因此Erns可作為防治豬瘟的一種靶蛋白。

在病毒感染過程中，細胞膜上的受體與病毒配體結合是介導病毒侵入宿主細胞的關鍵因素，也是病毒能否感染細胞的關鍵。因此，研究病毒受體和病毒配體之間的相互作用成為目前病毒致病機制研究的熱點問題之一，因為以其中的任何一個為藥物靶點都可以阻斷病毒與靶細胞的結合，從而抑制病毒的感染。關于CSFV配體的研究，已證實Erns蛋白參與了病毒的早期吸附，E1和E2蛋白形成的異源二聚體可以介導CSFV侵入宿主細胞，并且此異源二聚體還起到使哺乳動物細胞融合的作用。但是，究竟這三種蛋白的哪些氨基酸序列作為病毒配體與病毒受體結合，目前還沒有詳細的報道。

發明內容

本發明的目的是在于提供了豬瘟病毒Erns蛋白的抗原表位，所述抗原表位為：編碼1D5抗原表位的短肽，序列如SEQ ID NO.1：LATDTEL所示，定位在46-52AA。所述抗原表位可以與CSFV反應，而不與pCold-TF空載體發生反應，也不與Vero細胞發生反應。

本發明還有一個目的是在于提供了一種豬瘟病毒Erns蛋白的抗原表位在豬瘟病毒抗體藥物檢測試劑中的應用，該應用使得豬瘟病毒抗體診斷抗原可以用普通化學合成方法制備，相比基因工程表達蛋白做為診斷抗原，合成抗原工藝簡便，純度更高。

本發明的另一個目的是在于提供了一種豬瘟病毒Erns蛋白的抗原表位模擬肽的制備方法，該方法優點是利用噬菌體隨機肽庫來篩選豬瘟Erns單克隆抗體1D5識別的表位，可以篩選出與原始序列不同但功能相似的構象表位抗原，即模擬表位抗原。

為了實現上述的目的，本發明通過以下技術措施實現.

一種豬瘟病毒Erns蛋白的抗原表位的制備方法，其步驟是：

A、利用分子生物學對Erns主要抗原表位區域基因的擴增與重組質粒的構建。

B、將重組蛋白的誘導表達與純化，

C、利用純化蛋白進行小鼠免疫，獲得雜交瘤細胞和單克隆抗體。

D、單克隆抗體的穩定性和特異性檢測。

E、獲得上述特異性單克隆抗體的抗原表位，并對其進行鑒定。

一種豬瘟病毒Erns蛋白的抗原表位在制備治療或預防豬瘟病毒ELSIA抗體藥物檢測(試劑盒)中的應用，其步驟是：

1、以獲得的抗原表位作為參考化學合成抗原。

2、以合成抗原制備試劑盒主要組分抗原包被板。

3、按常規方法制備試劑盒其他組分。

4、使用試劑盒檢測血清中狂犬病病毒抗體。

本發明與現有技術相比，具有以下優點和效果：

1、本發明的抗原表位是由針對豬瘟病毒石門株的特定單抗篩選而來，具有極高的特異性和穩定性。

2、與現有的滅活病毒抗原或基因表達抗原技術相比，生產過程中不涉及菌種和毒株，工藝安全有保障，不會對環境造成污染。

3、利用獲得的抗原表位合成肽抗原與基因工程表達抗原相比，生產周期短，易純化且純度較高。