[發(fā)明專利]一種從發(fā)酵黑蒜中分離膠紅酵母的方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201710849080.1
• 申請日: 2017-09-14
• 公開（公告）號: CN107653195A
• 公開（公告）日: 2018-02-02
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 曹文濤;鄒顯友;何志勇;冷剛;鄒石銘
• 申請（專利權(quán)）人: 貴州東智生物科技有限公司
• 主分類號: C12N1/16
• 分類號: C12N1/16;C12N1/02;C12R1/645
• 代理公司: 貴陽東圣專利商標(biāo)事務(wù)有限公司52002
• 代理人: 袁慶云

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體來說涉及一種從發(fā)酵黑蒜中分離膠紅酵母的方法。

背景技術(shù)

黑蒜又名發(fā)酵黑蒜，是由大蒜經(jīng)高溫發(fā)酵成的半成品，是用新鮮生蒜，帶皮在發(fā)酵箱里發(fā)酵60-90天后制成的食品，黑蒜中的微量元素含量較高，味道酸甜，無蒜味，發(fā)酵黑蒜的抗氧化能力比普通大蒜的強。

膠紅酵母屬于擔(dān)子菌綱，菌落為奶油狀、粉紅色至紅色的粘液，是簡單的假菌絲，細(xì)胞形狀為圓形，為營養(yǎng)體細(xì)胞出芽生殖。富含蝦青素、類胡蘿卜素和β-葡聚糖。類胡蘿卜素是一種橘黃色脂溶性化合物，具有營養(yǎng)增補劑和食品著色劑的雙重功效。動物體內(nèi)不能合成類胡蘿卜素，必須由食物提供，它是動物體內(nèi)維生素A的重要來源，有補肝明目的作用，可治療夜盲癥。類胡蘿卜素也是一種抗氧化劑，進而防止老化和衰老引起的多種退化性疾病。同時，在抗癌、預(yù)防心腦血管疾病、白內(nèi)障上有顯著的功效。丙酮酸作為膳食補充劑，具有加速脂肪消耗、減輕體重等功效；對心臟有特殊的保護作用，可增強心臟肌肉的效能，減少心臟病或心臟局部缺血造成的損傷；同時，丙酮酸具有吞噬體內(nèi)自由基和抑制自由基的生成等顯著效果。

由于膠紅酵母的粘性特別強，不易得到形態(tài)特征明顯的單個菌落。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種容易得到形態(tài)特征明顯的單個菌落，富含蝦青素、類胡蘿卜素和β-葡聚糖的從發(fā)酵黑蒜中分離膠紅酵母的方法。

本發(fā)明的一種從發(fā)酵黑蒜中分離膠紅酵母的方法，包括以下步驟：

(1)取發(fā)酵黑蒜3顆，研磨后放到250mL的生理鹽水中，置于30℃的搖床中，震蕩2h；

(2)改良PDA配方：在PDA培養(yǎng)基中，瓊脂為22-25g/L，青霉素為150-200mg/L、200目石英砂為50-70g/L。

(3)將30mL上清液倒入改良PDA培養(yǎng)基中制成含菌培養(yǎng)基，倒平板置于30℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；

(4)2-3d后有長出了較多菌落，挑取一個單獨菌落在改良PDA平板上畫線分離，再次生長出單個菌落；

(5)反復(fù)從平板上挑取單個菌落轉(zhuǎn)種，最后就得到純種的膠紅酵母；

(6)挑少許菌落制片在顯微鏡下觀察，其顯微形態(tài)為圓形或橢圓形，無性繁殖為單邊芽殖。

菌種的保種和傳代：

保種用的培養(yǎng)基為PDA培養(yǎng)基。

保存方法有2種：

(1)用15×200mm的試管，盛PDA培養(yǎng)基5ml，做成斜面，接種真菌，30℃培養(yǎng)2～3天，置4℃保存。3個月轉(zhuǎn)種一次。

(2)甘油管保存法。挑取單個菌落置于5mL生理鹽水中，震蕩1分鐘，取1.5mL的離心管加入0.5mL菌液和0.5mL40％已滅菌的甘油，混勻后置-40℃，一年轉(zhuǎn)種一次。

分子生物學(xué)鑒定

將菌種接種到PDA培養(yǎng)基上活化2-3次，挑取單個菌落接種到100mL馬鈴薯液體培養(yǎng)基中，取1-2mL過夜培養(yǎng)的酵母菌培養(yǎng)液，加入1.5mL離心管中，室溫10000rpm離心一分鐘，棄上清，收集菌體。用SK8257_Ezup柱式酵母基因組DNA抽提試劑盒提取DNA，進行PCR擴增，PCR采用的引物為ITS1：

5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′；

ITS4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′。經(jīng)PCR擴增后用1％瓊脂糖凝膠電泳進行DNA電泳檢測，最后將序列進行測序。膠紅酵母H1(Rhodotorula mucilaginosa)FBKL3.0021的內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(internal transcribed spacer,ITS)的核酸序列長度為592個堿基，通過美國生物技術(shù)信息中心(National Center for Biorechnology Information,NCBI)進行序列同源性分析，將膠紅酵母H1(Rhodotorula mucilaginosa)序列通過Blast比對，發(fā)現(xiàn)其與Rhodotorula mucilaginosa菌種的同源性達到了100％，結(jié)合形態(tài)學(xué)特征，根據(jù)MycoBank數(shù)據(jù)庫鑒定該菌種為紅酵母屬中的膠紅酵母。

該菌種已于2017年5月12日保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心(地址：中國武漢武漢大學(xué))，保藏號：CCTCC M 2017254，名稱為：膠紅酵母H-1(Rhodotorula mucilaginosa H-1)。