[發明專利]一種端基含硫修飾的DNA及其制備方法

有效

• 申請號: 201710840355.5
• 申請日: 2017-09-18
• 公開（公告）號: CN107698641B
• 公開（公告）日: 2020-05-26
• 發明（設計）人: 孫亞偉;程童;姬燕云;王棟;王繼乾;徐海
• 申請（專利權）人: 中國石油大學（華東）
• 主分類號: C07H21/04
• 分類號: C07H21/04;C07H1/00
• 代理公司: 青島清泰聯信知識產權代理有限公司 37256
• 代理人: 欒瑜

1.一種端基含硫修飾的DNA的制備方法，其特征在于：包括以下步驟：

步驟一：制備亞磷酰胺硫辛醇酯：包括以硫辛酸為原料經還原反應得到硫辛醇后，經酯化反應得到亞磷酰胺硫辛醇酯的步驟；

步驟二：制備端基修飾的DNA：取亞磷酰胺硫辛醇酯溶于無水乙腈中作為端基修飾位試劑與DNA合成得到端基含硫修飾的DNA；

所述硫辛酸在無水四氫呋喃中以三甲氧基硼氫化鈉和硼酸作為還原劑制得硫辛醇；

所述端基含硫修飾的DNA的結構式如I所示：

所述的亞磷酰胺硫辛醇酯的結構如Ⅱ所示：

2.根據權利要求1所述的端基含硫修飾的DNA的制備方法，其特征在于：所述還原反應具體包括以下步驟：取三甲氧基硼氫化鈉和硼酸溶于無水四氫呋喃中，冰浴攪拌下加入硫辛酸，于15～25℃攪拌20～30h；

所述三甲氧基硼氫化鈉、硼酸和硫辛酸的質量比為依次為1～5：0.15～0.3：1，所述無水四氫呋喃溶液中硫辛酸的質量濃度為0.015～0.025g/mL。

3.根據權利要求2所述的端基含硫修飾的DNA的制備方法，其特征在于：所述還原反應結束后，向所述還原反應液中滴加硫酸溶液，過濾后取濾液加入氯仿和飽和食鹽水洗滌，分出有機相經干燥處理后，蒸發有機相得到硫辛醇。

4.根據權利要求3所述的端基含硫修飾的DNA的制備方法，其特征在于：滴加的所述硫酸溶液濃度為1～4mol/L，滴加的所述硫酸溶液中的硫酸與反應液中硫辛酸的質量比3.50～4.50:1，所述氯仿與飽和食鹽水的體積比為1～3：1。

5.根據權利要求1所述的端基含硫修飾的DNA的制備方法，其特征在于：所述酯化反應包括以硫辛醇為原料與2-氰乙基-N,N-二異丙基氯代亞磷酰胺在無水三乙胺和無水四氫呋喃中制備得到亞磷酰胺硫辛醇酯的步驟。

6.根據權利要求5所述的端基含硫修飾的DNA的制備方法，其特征在于：所述酯化反應具體包括以下步驟：取硫辛醇和無水三乙胺溶于無水四氫呋喃中，冰浴攪拌下滴加2-氰乙基-N,N-二異丙基氯代亞磷酰胺，于室溫下攪拌20～30h；

所述硫辛醇、無水三乙胺和2-氰乙基-N,N-二異丙基氯代亞磷酰胺的質量比為1.9:1.2:2.4；所述無水四氫呋喃中硫辛醇的質量濃度為0.035～0.040g/mL。

7.根據權利要求6所述的端基含硫修飾的DNA的制備方法，其特征在于：所述酯化反應結束后過濾，取濾液以飽和碳酸氫鈉溶液洗滌后，取有機相經無水硫酸鈉干燥得到亞磷酰胺硫辛醇酯。

8.根據權利要求7所述的端基含硫修飾的DNA的制備方法，其特征在于：所述步驟一具體步驟如下：取三甲氧基硼氫化鈉和硼酸溶于無水四氫呋喃中，冰浴攪拌下加入硫辛酸，于15～25℃攪拌20～30h，還原反應結束后，滴加濃度為1～4mol/L的硫酸溶液，過濾后取濾液加入氯仿和飽和食鹽水洗滌，分出有機相經干燥處理，并蒸發有機相得到硫辛醇；所述三甲氧基硼氫化鈉、硼酸和硫辛酸的質量比依次為1～5：0.15～0.3：1，所述無水四氫呋喃溶液中硫辛酸的質量濃度為0.015～0.025g/mL，滴加的所述硫酸溶液中的硫酸與反應液中硫辛酸的質量比3.50～4.50:1，所述氯仿與飽和食鹽水的體積比為1～3：1；

取硫辛醇和無水三乙胺溶于無水四氫呋喃中，冰浴攪拌下滴加2-氰乙基-N,N-二異丙基氯代亞磷酰胺，于室溫下攪拌20～30h，反應結束后過濾，取濾液以飽和碳酸氫鈉溶液洗滌后，取有機相經無水硫酸鈉干燥得到亞磷酰胺硫辛醇酯；所述硫辛醇、無水三乙胺和2-氰乙基-N,N-二異丙基氯代亞磷酰胺的質量比為1.9:1.2:2.4；所述無水四氫呋喃中硫辛醇的質量濃度為0.035～0.040g/mL；

所述步驟二中取合成后的產物分散于氨水中，并密閉加熱后，離心除去不溶物，取溶液經濃縮處理得到端基含硫修飾的DNA。