[發(fā)明專利]深色有隔內(nèi)生真菌HS40及其在鐵皮石斛生產(chǎn)上的應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710833508.3
• 申請(qǐng)日: 2017-09-15
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN107460133B
• 公開(kāi)（公告）日: 2018-07-03
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 藍(lán)桃菊;謝玲;張艷;陳艷露;張?chǎng)?/a>;蘇琴;覃麗萍;黃昌艷;盧家仕
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 廣西壯族自治區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)院微生物研究所
• 主分類號(hào): C12N1/14
• 分類號(hào): C12N1/14;C12N1/02;A01H4/00;C12R1/645
• 代理公司: 北京天奇智新知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11340
• 代理人: 韋玲雙

1.深色有隔內(nèi)生真菌HS40在鐵皮石斛生產(chǎn)上的應(yīng)用，其特征在于：包括深色有隔內(nèi)生真菌HS40在促進(jìn)鐵皮石斛平皿培養(yǎng)苗生長(zhǎng)上的應(yīng)用和深色有隔內(nèi)生真菌HS40在促進(jìn)鐵皮石斛盆栽苗生長(zhǎng)上的應(yīng)用；

所述的深色有隔內(nèi)生真菌HS40的保藏編號(hào)為CGMCC NO.14345。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的深色有隔內(nèi)生真菌HS40在鐵皮石斛生產(chǎn)上的應(yīng)用，其特征在于：所述的深色有隔內(nèi)生真菌HS40的分離包括以下步驟：

（1）樣品采集：選擇紅樹林優(yōu)勢(shì)樹種-木欖進(jìn)行采樣，采用五點(diǎn)采樣法采集木欖根、莖、葉部組織，放入4℃的冰盒中保存?zhèn)溆茫?/p>

（2）培養(yǎng)基的配置：菌株分離培養(yǎng)基使用1/2玉米粉培養(yǎng)基；純化培養(yǎng)基使用麥芽汁培養(yǎng)基或馬鈴薯培養(yǎng)基；宿主植物-西紅柿種子催芽使用純瓊脂培養(yǎng)基；栽培西紅柿以及培養(yǎng)真菌菌絲使用燕麥培養(yǎng)基；

（3）真菌的分離純化：對(duì)采集到的樣本組織進(jìn)行清洗和表面消毒，將表面消毒后的植物組織塊置于菌株分離培養(yǎng)基平板上，每皿3 塊組織塊，每個(gè)樣本5皿，于25℃培養(yǎng)逐日觀察是否有菌絲長(zhǎng)出，待菌絲從組織塊部位長(zhǎng)出后及時(shí)轉(zhuǎn)接到純化培養(yǎng)基上，獲得純化的真菌菌株；

（4）內(nèi)生真菌的篩選：為排除致病性菌和腐生菌，根據(jù)菌落形態(tài)、產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)將步驟（3）所述的純化的真菌菌株進(jìn)行分組，每組隨機(jī)取一株代表菌株進(jìn)行致病性測(cè)定，具體步驟如下：

（a）將菌株接種于燕麥培養(yǎng)基，每皿3個(gè)菌塊，培養(yǎng)7?14d，得到培養(yǎng)好的菌落備用；

（b）真菌致病性檢測(cè)用宿主植物-西紅柿種子經(jīng)表面消毒、在純瓊脂培養(yǎng)基上催芽，待種子發(fā)成幼苗后移栽至培養(yǎng)好的菌落上；

（c）在每個(gè)菌落上分別移栽1株無(wú)菌西紅柿幼苗，每皿3株苗，將培養(yǎng)皿放入組培瓶中，于溫度為26℃、光照強(qiáng)度為1000-1200Lx和光照時(shí)間為16h/d的培養(yǎng)箱中共培養(yǎng)；每個(gè)菌株共接種12株西紅柿幼苗，即每個(gè)菌株設(shè)4個(gè)重復(fù)；

（d）以未接種菌株、直接移栽的西紅柿幼苗的處理為對(duì)照；

（e）14d后記錄西紅柿幼苗的發(fā)病情況，并將西紅柿根部洗凈后放入50℃烘箱中烘干至恒重后稱量干重；

（f）對(duì)不表現(xiàn)病癥、生物量與對(duì)照差異不顯著的菌株處理進(jìn)行再分離，確定再分離菌株是否為原接種菌株；

（5）內(nèi)生真菌根部定殖觀察：選取上述步驟（4）中無(wú)病癥的西紅柿幼苗進(jìn)行根部切片和棉蘭染色，在顯微鏡下觀察根組織中的菌絲分布、顏色和形態(tài)，初步明確內(nèi)生真菌的定殖情況。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的深色有隔內(nèi)生真菌HS40在鐵皮石斛生產(chǎn)上的應(yīng)用，其特征在于：所述的深色有隔內(nèi)生真菌HS40的鑒定方法包括以下步驟：

（1）通過(guò)形態(tài)學(xué)觀察，初步判斷其分類地位；

（2）是挑取菌絲直接用于PCR反應(yīng)，rRNA的ITS1-5.8S-ITS4-28S部分區(qū)域PCR擴(kuò)增采用通用引物ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和LR5(5′-TCCTGAGGGAAACTTCG-3′)；rRNA的18SrRNA區(qū)段PCR擴(kuò)增采用引物NS1(5′-GTAGTCATATGCTTGTCTC-3′)和NS4(5′-CTTCCGTCAATTCCTTTAAG-3′)，PCR反應(yīng)體系：2×EasyTaq PCR SuperMix 25μL，20μmol/L正反引物各1μL，模板DNA 1μL，用ddH₂O定容至50μL。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的深色有隔內(nèi)生真菌HS40在鐵皮石斛生產(chǎn)上的應(yīng)用，其特征在于：步驟（2）所述的PCR反應(yīng)的條件為：依次在98℃下反應(yīng)2 min、在94℃下反應(yīng)40s、在50℃下反應(yīng)1min和在68℃下反應(yīng)4min，30個(gè)循環(huán)，最后在72℃下反應(yīng)10min。

5.根據(jù)權(quán)利要求1-4任意一項(xiàng)所述的深色有隔內(nèi)生真菌HS40在鐵皮石斛生產(chǎn)上的應(yīng)用，其特征在于：對(duì)在平皿培養(yǎng)中接種了HS40菌株的鐵皮石斛苗，進(jìn)行根部切片和棉蘭染色，在顯微鏡下觀察根組織中的菌絲分布、顏色和形態(tài)，以明確HS40菌株的定殖情況。