[發明專利]一種從太湖激浪魚內臟中篩選藻毒素降解菌的方法

在審

• 申請號: 201710832718.0
• 申請日: 2017-09-15
• 公開（公告）號: CN107739722A
• 公開（公告）日: 2018-02-27
• 發明（設計）人: 張文藝;董小娜;毛林強;陳澤慧;郭惠娟
• 申請（專利權）人: 常州大學
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12N1/02;C02F3/34;C12R1/01
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種通過添加提取的藻毒素做底物從太湖激浪魚內臟分離篩選出來的MC-LR降解菌JZ-4，殺鮭氣單胞菌亞種(Aeromonas salmonicida subsp.salmonicida)，保藏編號：CGMCC No.14051。

2.權利要求1所述的一種從太湖干藍藻中提取高藻毒素MC-LR的方法，按照下述步驟進行：

①攪拌：對提取比例為100g藻粉：100mL 60％甲醇溶液的混合液進行磁力攪拌2h(160r min^-1)，使其充分溶解；

②細胞破碎：對混合溶液進行超聲波細胞破碎60min，靜止20min，取上清液；

③離心：使用離心機離心15min(10000r min^-1)；

④調pH去除蛋白：收集離心后上清液，用稀硫酸調節pH值為4，靜止12h；

⑤過濾：通過0.45μm濾膜過濾；

⑥調pH至中性：收集濾液，用稀氨水(5％)調節pH值至7左右；

⑦旋轉蒸發：濾液60℃旋轉蒸發去甲醇；

⑧固相萃取：稀釋后的粗提液流經固相萃取柱進行富集濃縮，并用甲醇梯度洗脫；

⑨氮氣吹干：利用氮氣吹干儀吹干洗脫液中的殘留液體；

⑩滅菌保存：用甲醇相或水相重新溶解，高溫消毒滅菌20min(1×10⁵Pa)，-20℃保存作為MCs儲備液。

3.權利要求1所述的一種MC-LR降解菌的分離方法，按照下述步驟進行：

①MC-LR降解菌初篩培養基組為牛肉膏蛋白胨培養基：牛肉膏3g；蛋白胨10g；氯化鈉5g，加水到1000mL，充分溶解，用1mol/L的NaOH和HCl調節溶液pH值到7.0，121℃滅菌20min，牛肉膏蛋白胨固體培養基則在此基礎上加1％-2％的瓊脂粉。

②MC-LR降解菌復篩培養基組M9培養基：Na₂PO₄·7H₂O 12g；KH₂PO₄ 3g；NaCl 0.5g；NH₄Cl 1g，加水到1000mL，充分溶解，用1mol L^-1的NaOH和HCl調節溶液pH值到7.0，121℃滅菌20min。

③稱取3g已研磨的太湖激浪魚內臟加入27mL蒸餾水中，30℃恒溫振蕩6h(134r min^-1)使得魚內臟與水完全混合。

③取1mL上層清液，按照倍比稀釋法，依次制備10^-2、10^-3…...10^-8稀釋液；后用移液槍吸取0.1mL稀釋液進行涂布，稀釋涂布的培養基采用M9培養基(添加MC-LR做底物)，30℃恒溫培養3d，挑取優勢菌落進行劃線純化。將純化的菌株接種于牛肉膏蛋白胨斜面上，30℃恒溫培養3d，4℃保存，每月繼代一次。

④將分離出來的菌株分別接種于液體牛肉膏蛋白胨培養基中，30℃恒溫振蕩培養(150rmin^-1)。

⑤3d后，取菌液接種于20mL添加MC-LR做底物的M9液體培養基中，接種量為3％，30℃恒溫振蕩培養(150r min^-1)，設置3組重復，同時做空白對照實驗，空白對照中加3％的無菌水，3d后測菌液中MC-LR的含量。

⑥經過反復的平板劃線及MC-LR去除效率的檢驗，最終得到1株高效的MC-LR降解菌。

4.根據權利要求書1所述的藻毒素降解方法，其特征在于按照下述步驟進行：

將菌液接種于裝有20mL添加MC-LR作底物的M9的液體培養基的錐形瓶中，接種量為3％，30℃，150r min^-1恒溫振蕩培養，每隔24h取樣，采用酶聯免疫法測定MC-LR含量，考察降解能力。

5.根據權利要求書1所述的藻毒素降解方法，其特征在于：

考察不同pH(5.5、7.0、8.5)及不同MC-LR添加量(5μg L^-1、10μg L^-1、20μg L^-1、30μg L^-1)時的，對菌株降解MC-LR降解效果的影響，最終得到最佳降解條件。