[發明專利]重組蝗綠僵菌及其制備方法和應用

有效

• 申請號: 201710830876.2
• 申請日: 2017-09-12
• 公開（公告）號: CN107502562B
• 公開（公告）日: 2020-06-23
• 發明（設計）人: 王云丹;胡帥;康樂
• 申請（專利權）人: 中國科學院動物研究所
• 主分類號: C12N1/15
• 分類號: C12N1/15;A01N63/30;A01P7/04;C12R1/645
• 代理公司: 北京布瑞知識產權代理有限公司 11505
• 代理人: 孟潭

本發明提供一種重組蝗綠僵菌，其能夠表達磷酸甘油酸激酶。在該重組蝗綠僵菌中導入的基因為磷酸甘油酸激酶基因，其能夠顯著提高專性菌蝗綠僵菌中果糖?6?磷酸的濃度，顯著提高殺蟲效率，使蝗綠僵菌的半致死時間LT50從7.045±0.211天縮短到5.617±0.187天；且對環境無害，生物安全性好，對人類無毒性。

技術領域

本發明涉及轉基因菌株及其制備方法和用途，尤其涉及能夠提高專性菌蝗綠僵菌殺蟲效率的重組蝗綠僵菌及其制備方法和應用。

背景技術

昆蟲病原真菌，相較于化學殺蟲劑，具有環境友好、抗逆性強、能大量擴散、選擇性高等優點，是廣泛應用的一類生物農藥。然而，目前昆蟲病原真菌作為殺蟲劑仍然存在著致死時間較長的缺點。通過研究真菌致病機理，利用基因工程手段改造真菌，提高真菌殺蟲劑的效果是當前研究的一個重要方向。例如：

1、高表達真菌分泌的水解酶類基因。過表達體壁降解蛋白酶如枯草桿菌蛋白酶(subtilisins)Pr1A可以提高真菌穿透體壁的速度，顯著提高了金龜子綠僵菌的毒力，加快致死速度并且在血腔中激活多酚氧化酶原系統，導致蟲體迅速黑化，對煙草天蛾的致死時間減少了25％，害蟲的取食率也降低了40％。Fang等將幾丁質水解酶Bbchitl基因轉入白僵菌基因組中，獲得超表達工程菌株。工程菌株對蚜蟲的毒力明顯增強。與野生菌株相比，工程菌株對蚜蟲的致死劑量降低50％，致死時間縮短50％。

2、對真菌代謝基因的改造。Xia等通過構建真菌酸性海藻糖降解酶(ATM)超表達載體，轉化廣譜綠僵菌，增強真菌對寄主血淋巴中海藻糖的代謝能力，促進廣譜綠僵菌在昆蟲體內生長。

3、引入外源基因。北非蝎毒素(Androctonus australis neurotoxin)AaIT是鱗翅目、雙翅目昆蟲的特異性神經毒素。Wang等人將該基因導入綠僵菌后，能在寄主血腔中特異性表達神經毒素，改造后的真菌對煙草天蛾的毒性提高了22倍。

4、表達與免疫相關的基因。Yang等人在白僵菌中表達昆蟲先天免疫識別通路Toll信號通路的絲氨酸抑制酶Spn43Ac，對桃蚜的半致死時間減少了24％，致死率提高了2倍。Fan等將葡萄糖-果糖氧化還原酶(Glucose-frustose oxidoreductase GFOR)基因基因導入白僵菌中，構建的轉基因工程菌通過合成葡萄糖酸內酯(GDL)可以抑制寄主革蘭氏陰性細菌結合蛋白(Gram-negative bacteria binding proteins GNBPs)的活性，抑制宿主的免疫反應，使真菌的致死時間減少了48h，殺蟲效果得到提高。

但目前通過基因工程手段改造真菌仍然存在一些缺陷。例如，中國發明專利授權公告號為CN101755050公開的將優化的編碼北非蝎(Androctonus australis)神經毒素AaIT的多核苷酸序列導入金龜子綠僵菌(Metarhizium anisopliae)中并表達，其可提高殺蟲效率，有效用于昆蟲的控制。但導入真菌中的蝎毒基因對人類有毒，會對人類造成一定危險。

另外，通過基因工程手段改造的真菌，大多數對昆蟲不特異。如白僵菌和金龜子綠僵菌(廣譜綠僵菌)，在防治害蟲的同時，有益的昆蟲也能被殺死，造成生態災害。

在真菌侵染寄主的過程中，細胞壁糖蛋白和真菌多糖代謝與真菌生長分化、致病性、對寄主免疫響應的適應密切相關。寄主先天免疫的第一步是對外來病原體的識別。真菌細胞壁上的病原相關分子模式(Pathogen-associated molecular patterns，PAMPs)，如β-1,3-葡聚糖、甘露糖等，會被模式識別受體PRRs，包括C型凝集素、肽聚糖識別蛋白、革蘭氏陰性菌結合蛋白(GNBP)等的免疫識別，引起免疫響應。