[發明專利]一種檢測人基因組的競爭性實時熒光PCR SNP探針

有效

• 申請號: 201710829135.2
• 申請日: 2017-09-14
• 公開（公告）號: CN107400722B
• 公開（公告）日: 2020-02-07
• 發明（設計）人: 林志鏗;楊璐平;王松林
• 申請（專利權）人: 廈門為正生物科技股份有限公司
• 主分類號: C12Q1/6858
• 分類號: C12Q1/6858;C12N15/11
• 代理公司: 35200 廈門南強之路專利事務所(普通合伙)
• 代理人: 馬應森

一種檢測人基因組的競爭性實時熒光PCR SNP探針，涉及單核苷酸多態性探針。具有二級結構，包含與完全不互補序列且具備水解性的半環狀結構以及完全互補序列的熒光探針，在于SNP位于熒光探針的5’端，并且在熒光探針的3’端設計3～5個堿基，使其與熒光探針的5’端結合，從而形成二級結構。另外，在3’端附近外加3～7個不與探針自身互補的堿基。此特殊結構可大大提高水解性，降低熒光本底信號，從而提高實時PCR的靈敏度，增加探針的特異性降低假陽性率。大大提高人體基因組SNP檢測的靈敏度及特異性，降低假陽性率，同時又經濟簡便。

技術領域

本發明涉及單核苷酸多態性(Single Nucleotide Polymorphism，SNP)探針，尤其是涉及一種檢測人基因組的競爭性實時熒光PCR SNP探針。

背景技術

單核苷酸多態性(Single Nucleotide Polymorphism，SNP)，主要是指在基因組水平上由單個核苷酸的變異所引起的DNA序列多態性。它是人類可遺傳的變異中最常見的一種，占所有已知多態性的90％以上。SNP在人類基因組中廣泛存在，平均每500～1000個堿基對中就有1個，估計其總數可達300萬個甚至更多。

SNP所表現的多態性只涉及到單個堿基的變異，這種變異可由單個堿基的轉換(Transition)或顛換(Transversion)所引起，也可由堿基的插入或缺失所致。但通常所說的SNP并不包括后兩種情況。

理論上講，SNP既可能是二等位多態性，也可能是3個或4個等位多態性，但實際上，后兩者非常少見，幾乎可以忽略。因此，通常所說的SNP都是二等位多態性的。這種變異可能是轉換(C T，在其互補鏈上則為G A)，也可能是顛換(C A，G T，C G，A T)。轉換的發生率總是明顯高于其它幾種變異，具有轉換型變異的SNP約占2/3，其它幾種變異的發生幾率相似。Wang等的研究也證明了這一點。轉換的幾率之所以高，可能是因為CpG二核苷酸上的胞嘧啶殘基是人類基因組中最易發生突變的位點，其中大多數是甲基化的，可自發地脫去氨基而形成胸腺嘧啶。

在基因組DNA中，任何堿基均有可能發生變異，因此SNP既有可能在基因序列內，也有可能在基因以外的非編碼序列上。總的來說，位于編碼區內的SNP(coding SNP,cSNP)比較少，因為在外顯子內，其變異率僅及周圍序列的1/5。但它在遺傳性疾病研究中卻具有重要意義，因此cSNP的研究更受關注。

目前，檢測SNP的常用方法包括PCR-直接測序法、PCR-焦磷酸測序法、熒光定量PCR法、PCR-基因芯片法、PCR-電泳分析、PCR-高分辨率熔解曲線法、等位基因特異性PCR法、PCR-限制性片段長度多態性方法、原位雜交(ISH)等多種方法，每種方法的原理和優缺點如下：

1)PCR-直接測序法

也稱PCR-Sanger測序，該方法基于雙脫氧核糖核酸(ddNTP)末端終止法，根據核苷酸在某一固定點開始延伸，隨機在某一特定堿基處終止，由于摻入的每個堿基都進行了熒光標記，因此產生了以A、T、C、G結束的四組相差一個堿基的不同長度的系列核酸片段；通過毛細管電泳分離這些片段后讀取待測核酸的堿基序列。Sanger法測序是DNA序列分析的經典方法。由于該方法可直接讀取DNA的序列，因此被認為是基因分型的金標準。

PCR-Sanger測序法的操作過程主要包括PCR擴增和PCR產物純化、測序反應、測序和結果分析四個主要步驟。分析時需要設置陰性對照和陽性質控品。該方法屬于定性檢測，優點是測序長度較長，可發現新的變異位點。主要不足：靈敏度不高，尤其是在進行腫瘤組織體細胞突變檢測時，當組織中靶標基因突變比例低于20％時，可能出現假陰性結果；對試劑和儀器有特殊要求，不易普及；操作復雜，成本相對較高，速度慢、通量低。

2)PCR-焦磷酸測序法