[發明專利]一種獸用復合免疫佐劑及其制備方法和應用

在審

• 申請號: 201710825503.6
• 申請日: 2017-09-14
• 公開（公告）號: CN107441486A
• 公開（公告）日: 2017-12-08
• 發明（設計）人: 羅滿林;鄒舒展;李冰;張賀;曾繁文;陳安妮;勾雄
• 申請（專利權）人: 華南農業大學
• 主分類號: A61K39/39
• 分類號: A61K39/39;A61P37/04;A61P31/12
• 代理公司: 桂林市華杰專利商標事務所有限責任公司45112
• 代理人: 楊雪梅

技術領域

本發明涉及獸醫免疫學和生物制藥領域，具體是一種獸用復合免疫佐劑及其制備方法和應用。

背景技術

自1798年英國醫生琴納(Jenner) 創立應用牛痘膿皰制成疫苗預防天花以來，疫苗的研究和應用已經有了200多年的歷史, 其間經歷了經典減毒疫苗、細胞疫苗、分子水平疫苗的發展歷程。無論是以感染組織或雞胚的胚液制備的疫苗還是以人工感染的細胞培養物制成的疫苗, 都曾經也正在對預防人類和動物傳染病發揮重要作用。1925年，法國免疫學家拉蒙（Gaston Ramon）首次發現在疫苗中加入某些物質可以特異性地增強機體的免疫應答反應，從而拉開了使用佐劑的序幕。佐劑（Adjuvants）是一種非特異性免疫增強劑，臨床上常在疫苗免疫前單獨加入或與疫苗混合注入動物體內，用以增強動物機體對抗原或免疫原的免疫應答反應或改變其免疫應答類型，特別是在再次免疫應答中，其增強作用更加明顯。實踐證明，疫苗與佐劑的聯合應用，不僅可以顯著提高疫苗的免疫效果，還可以減輕動物機體的免疫耐受。常用的佐劑主要有不溶性鋁鹽類膠體、油水乳劑、微生物及其代謝產物、核酸及其類似物、細胞因子、免疫刺激復合物、蜂膠、脂質體等。

不同類型的佐劑作用方式不同，如弗氏完全佐劑主要在抗原遞呈過程中起作用，而佐劑中含糖(如皂苷)或其他碳水化合物則會增加免疫原傳遞到巨噬細胞和DC的數量。總的來說，免疫佐劑主要通過免疫調節、參與抗原遞呈、誘導CD8+細胞應答、抗原貯存等方式發揮作用。

理想的免疫佐劑應符合以下幾條標準: ①無致癌性，無毒副作用；②用于食用動物不應有藥物殘留；③能促進抗原引起體液和細胞免疫；④能以不同途徑免疫，也能用于不同抗原；⑤在動物體內能被降解吸收；⑥不含與動物有交叉反應的抗原物質；⑦不應誘發自身超敏反應；⑧使用穩定，正常條件下不易分解和變質。

現有研究表明，將多種不同作用機制的佐劑聯合起來應用，能有效激活復雜有序的天然免疫系統并產生預想的獲得性免疫應答。如弗氏不完全佐劑 (IFA )與純化的皂苷成分 (QS21)、 IL- 12 等可溶性 、有佐劑活性的分子聯用對低免疫原性及需要 Thl型應答的抗原很有價值；以皂苷 、單磷酸脂質 A (MPL)和分枝桿菌細胞壁混合而成的RiBiDetox水包油佐劑與H IV-1疫苗共用時，可誘導較強的Th l型應答（Jensen FC等，1998）。

基于此，本發明選用三種臨床經常使用的佐劑作為原料，通過臨床免疫增強試驗，旨在篩選出一種安全、高效的復合免疫佐劑。

發明內容

本發明的目的在于針對現有技術的不足，而提供一種獸用復合免疫佐劑及其制備方法和應用，這種獸用復合免疫佐劑具有安全性高、高效多能的特點。

實現本發明目的的技術方案是：

一種獸用復合免疫佐劑，由下述重量配比的原料制成：

胞壁酰二肽37.5-150mg/mL；

鹽酸左旋咪唑7.5-67.5 mg/mL；

刀豆素25-225 mg/mL。

優選地，獸用復合免疫佐劑由以下重量配比的原料制成：

胞壁酰二肽150 mg/mL；

鹽酸左旋咪唑7.5 mg/mL；

刀豆素25 mg/mL。

上述獸用復合免疫佐劑的制備方法，按照上述原料的重量配比取各原料混入含有抗原的水相，再取油相，按照體積比水相:油相=1:2乳化，制備成含有獸用復合免疫佐劑的滅活疫苗。

制得的滅活疫苗，給小鼠肌肉注射100μL /只，14天后二免。

確定上述獸用復合免疫佐劑最佳組分含量的方法，包括以下步驟：

（1）確定三種制劑組分：胞壁酰二肽、鹽酸左旋咪唑和刀豆素；

（2）設計如表一所示的三種組分的三種不同注射劑量：

表一：三種組分的三種不同注射劑量

（3）進行不同劑量單組分的小鼠免疫試驗，得到不同劑量的小鼠血清細胞因子濃度以及特異性抗體水平；

（4）根據步驟（3）的小鼠血清細胞因子濃度以及特異性抗體水平，結合最終的攻毒保護率，綜合這幾項指標，得出高劑量的胞壁酰二肽無論在細胞因子分泌水平或是抗體生成水平上都均比同組的其他劑量效果顯著，而低劑量的鹽酸左旋咪唑和刀豆素效果更佳，因此選擇①組（左低+刀低），②組（左低+胞高）， 組（刀低+胞高）和組（刀低+左低+胞高）組成復方進行下一步的免疫試驗，其中胞高為高劑量胞壁酰二肽，左低為低劑量鹽酸左旋咪唑，刀低為低劑量刀豆素；