[發明專利]一種NF2-/-

有效

• 申請號: 201710822683.2
• 申請日: 2017-09-13
• 公開（公告）號: CN109486765B
• 公開（公告）日: 2021-11-19
• 發明（設計）人: 劉丕楠;趙賦;何琪楊;張晶;陳陽
• 申請（專利權）人: 趙賦
• 主分類號: C12N5/079
• 分類號: C12N5/079
• 代理公司: 深圳深瑞知識產權代理有限公司 44495
• 代理人: 晁陽飛

本發明公開了人NF2^?/?前庭神經鞘瘤施旺細胞系的建立方法及其細胞系。該建立方法包括：A、對腫瘤中的施萬細胞(Schwann cel l)進行分離，獲得人NF2^?/?的原代施萬細胞(human NF2^?/?Schwann cel l)進行原代培養；B、建立免疫缺陷小鼠坐骨神經人NF2^?/?原代施萬細胞移植瘤模型；C、從小鼠坐骨神經上篩選直徑大于1cm的移植瘤；D、分離施萬細胞，進行原代細胞培養；E、進行連續5代以上傳代培養；F、在篩選獲得與人NF2^?/?的原代施萬細胞、移植瘤原代細胞株細胞形態及主要生物學特征一致，并且能無限傳代的NF2^?/?前庭神經施旺細胞。該細胞有95％以上的成功率長出移植瘤。

技術領域

本發明涉及細胞培養技術領域，尤其涉及一種NF2^-/-前庭神經鞘瘤施旺細胞系的建立方法及其細胞系。

背景技術

施旺細胞是周圍神經系統的主要功能細胞，它不但具有遷移、粘著、產生細胞外基質、形成髓鞘,參與周圍神經修復的功能,也可分泌多種神經因子和生物活性物質,促進神經元和神經膠質細胞的存活、抑制其凋亡和促進其再生,從而對中樞神經損傷進行修復。施旺細胞的發生腫瘤性增生會形成神經鞘瘤(又名施旺氏細胞瘤，schwannoma)，該腫瘤為良性腫瘤，延周圍神經生長，可各種年齡、不同性別均可發生。當神經鞘瘤壓迫神經組織時，則可發生感覺及運動功能障礙，造成相應的部位發生疼痛與麻木、以及運動功能喪失。神經鞘瘤發生于顱神經較周圍神經者更為常見，其中最常見的類型為發生于前庭蝸神經的前庭神經鞘瘤，通常被稱為聽神經瘤。大多數前庭神經鞘瘤為散發，會引起患者耳聾、面癱等神經功能癥狀，當腫瘤增大時會引起腦積水、意識障礙等嚴重癥狀，危機生命。

2型神經纖維瘤病(Neurofibromatosis Type 2,NF2)是一種常染色體顯性遺傳性疾病，由常染色體22q12上的NF2腫瘤抑制基因突變引起。該病會引起患者全身多發的神經鞘瘤，而雙側前庭神經鞘瘤(聽神經瘤)是NF2標志性特征，95％以上的NF2患者都會發生雙側前庭神經鞘瘤。該腫瘤會隨著腫瘤生長，造成進行性的雙側的聽力損害、面癱、癱瘓及平衡障礙等嚴重癥狀，危及患者生命，并導致患者出現社交障礙并誘發抑郁癥。目前治療NF2前庭神經鞘瘤的主要方法只有手術切除和放射治療，這兩種治療均會引起顱神經損傷，導致嚴重的并發癥。靶向藥物治療是目前研究的重點，但到目前為止，缺少有效的藥物治療方法。此外，NF2基因也是導致散發神經鞘瘤(Sporadic schwannoma)、腦膜瘤等形成的重要基因。

在病理和藥物研究過程中，良好的神經鞘瘤細胞系能快速、深入地分析腫瘤分子和細胞的功能，并對潛在的治療化合物進行篩選，也是建立神經鞘瘤動物模型的基礎。然而，全世界目前只有1例可供細胞學和實驗動物NF2前庭神經鞘瘤細胞系，由美國House耳研所的Gene Hung博士等人創建。他們從一個 56歲NF2患者身上獲得腫瘤組織，培養原代施旺氏細胞瘤，并通過導入人乳頭瘤病毒(HPV)的E6-E7基因成功使細胞永生化，該細胞系稱為HEI193[1]。但是，致癌基因的轉染導致HEI193細胞系與原代細胞相比，在分子特征及細胞形態上發生改變，限制了其作為人前庭神經鞘瘤模型的作用[1]。此外，HEI193 細胞系取自56歲NF2患者，NF2基因突變為15號外顯子剪切位點區域，導致編碼蛋白Merl in部分功能缺失，絕大多數NF2患者突變為無義突變或大片段缺失，形成截頂蛋白(truncat ingprotein)。因此，該細胞系無法完全用于實現NF2神經鞘瘤的全部生物學特征。

還有一些實驗室通過改進原代細胞培養方法，采用前庭神經鞘瘤原代培養細胞進行體外藥物實驗的研究，但其仍然存在以下幾個問題：

1)原代細胞生長緩慢，一般7～14天生長至90％匯合。

2)原代細胞傳至5代后，細胞形態發生改變，S100(施旺氏細胞特征性表達蛋白)蛋白表達下降，部分細胞衰老，主要信號通路關鍵蛋白表達改變。