[發(fā)明專利]一種誘導(dǎo)植株矮化的遺傳轉(zhuǎn)化體系及其構(gòu)建和應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710819404.7
• 申請(qǐng)日: 2017-09-12
• 公開（公告）號(hào): CN107557384B
• 公開（公告）日: 2020-09-01
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 崔寶祿
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 黔南民族師范學(xué)院
• 主分類號(hào): C12N15/84
• 分類號(hào): C12N15/84;A01H5/04;A01H6/82
• 代理公司: 北京聯(lián)創(chuàng)佳為專利事務(wù)所(普通合伙) 11362
• 代理人: 郭防;張梅

1.一種SlGT-33基因誘導(dǎo)番茄矮化的用途,其特征在于，將攜帶有SlGT-33基因沉默片段的沉默載體轉(zhuǎn)移到農(nóng)桿菌后,再用所述農(nóng)桿菌侵染番茄子葉；其中, SlGT-33基因如序列1所示；誘導(dǎo)番茄矮化的過程包括：（1）番茄RNA的提取；（2）番茄總RNA反轉(zhuǎn)錄；（3）SlGT-33基因的克隆；（4）沉默載體的構(gòu)建，構(gòu)建中用到的引物為SlGT-33 -F：5'CTTCCTGTTCACGACCCTTC 3'；

SlGT-33-R：5' CTCTCAATTTTGGACCCCC 3'；

（5）將步驟（4）獲得的沉默載體轉(zhuǎn)移到農(nóng)桿菌；（6）將步驟（5）獲得的農(nóng)桿菌侵染番茄子葉；（7）獲得矮化的轉(zhuǎn)基因番茄植株。

2.如權(quán)利要求1所述誘導(dǎo)番茄矮化的用途，其特征在于：所述的番茄RNA的提取，是番茄組織放入液氮中速凍10~20s后放入研缽，研磨后，取98-102mg粉末放入1.5mL離心管中，加入0.8-1.2mL RNAiso Plus提取試劑，震蕩混勻，室溫靜置4-6min后，混合液在3-5℃下13100 rpm離心4-6min，吸取上清液880-920μL放入到新1.5mL的離心管中，并加入三氯甲烷245-265μL，混勻后，常溫靜置4-6min；混合液3-5℃下12500- 13500rpm離心13-17min，吸取最上層澄清液體180-220μL于新的1.5mL的離心管中，加入180-220μL濃度為99-100%的異丙醇，上下顛倒混勻，室溫靜置4-6min，將混合液3-5℃下13000-13200 rpm離心8-12 min，倒掉上清液，并加入1mL70乙醇，3-5℃下13000-13200rpm離心50-70s，倒掉上清液，吸干殘留液體，常溫靜置干燥；待干燥后加入滅菌的無離子水20~30μl溶解，即得。

3.如權(quán)利要求1所述誘導(dǎo)番茄矮化的用途，其特征在于：所述的SlGT-33基因的RNA反轉(zhuǎn)錄，是在無菌的環(huán)境下，于滅菌的離心管中加入如下反應(yīng)體系的試劑：番茄RNA0.8-1.2μL、引物1.8-2.2μL、無離子水10-12μL，將加好試劑的離心管放到PCR儀上，74-76℃孵育4-6min；孵育結(jié)束后迅速放到冰上冷卻4-6min，并加入4-6倍的buffer緩沖液5×ReactionBuffer 4μL、dNTP 2μL、莫洛尼鼠白血病病毒反轉(zhuǎn)錄酶0.8-1.2μL和無離子水8-10μL后，放在PCR上40-44℃溫育50-70min，再升高到70-74℃孵育8-12min，取出，零下20℃保存；所述的引物是1.8-2.2mmoL/L的oligodT。

4.如權(quán)利要求1所述誘導(dǎo)番茄矮化的用途，其特征在于：所述的SlGT-33基因的克隆，是利用引物SlGT-33-F和SlGT-33-R擴(kuò)增番茄基因SlGT-33，反應(yīng)體系試劑如下：2×PrimeSTARMix，12.5μL；SlGT-33-F，1.0μL；SlGT-33-R，1.0μL；cDNA模板1.0μL；無菌水9.5μL；加好后，在PCR儀上放置后進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增的條件如下：變性98℃，2min；復(fù)性58℃，30s，片段固定72℃，10min，得到PCR的擴(kuò)增產(chǎn)物；

所述的沉默載體的構(gòu)建；是PCR的擴(kuò)增產(chǎn)物連接到pMD18-T載體上，測序，獲得克隆片段的編碼序列，在5'加入了酶切位點(diǎn)，合成引物SlGT-33 -F和SlGT-33-R，分別以正向和反向的方式連接到中間載體pHANNIBAL上，然后連接到終載體pBIN19上，獲得含有SlGT-33基因沉默片段的沉默表達(dá)終載體。