[發明專利]端粒酶催化亞基全基因過表達腺病毒重組載體及其應用

在審

• 申請號: 201710817865.0
• 申請日: 2017-09-12
• 公開（公告）號: CN107418976A
• 公開（公告）日: 2017-12-01
• 發明（設計）人: 周其岡;朱東亞;吳海銀;徐述;劉夢穎
• 申請（專利權）人: 南京醫科大學
• 主分類號: C12N15/861
• 分類號: C12N15/861;C12N15/65;A61K48/00;A61P25/24
• 代理公司: 北京精金石專利代理事務所(普通合伙)11470
• 代理人: 強紅剛

技術領域

本發明屬于生物制藥領域，具體而言，涉及用于基因治療的腺病毒重組載體，該腺 病毒重組載體能夠阻斷慢性應激導致的成年海馬神經元發生低下，治療慢性應激導致的 抑郁癥。

背景技術

端粒酶是一種自身攜帶模板的逆轉錄酶，能夠催化DNA末端的端粒合成，其組成包 括端粒酶催化亞基(TERT)、端粒酶相關蛋白(TR)和端粒酶RNA組分(TERC)。 端粒酶主要在干細胞中存在，在神經干細胞中大量表達。隨著細胞的發育分化成熟，細 胞中的端粒酶含量逐漸下降直至消失。但是，在成年腦中仍然有兩個神經干細胞池，包 括海馬的顆粒細胞下層和側腦室的室管膜下層。這兩部位的神經干細胞被稱之為成年干 細胞，這些成年干細胞每天都在分裂增殖，產生大量的新生的神經元。這些神經元經過 分化、發育為成熟的神經元和膠質細胞融入到已有的神經環路中發揮功能。海馬成年干 細胞表達大量的端粒酶，參與海馬成年干細胞的增殖、分化等過程。實驗證實海馬端粒 酶缺乏會導致海馬成年干細胞的增殖能力下降、發育為神經元的比例下降。

目前，尚沒有文獻報道過端粒酶過表達在治療抑郁癥方面的應用。

發明內容

本發明人在前期的研究中發現，慢性應激可以導致成年海馬中的端粒酶表達和活性 下降，通過降低神經元發生誘導抑郁行為。

既然成年海馬端粒酶功能下降與抑郁行為相關，因此本發明人創造性地探索了過表 達海馬中的端粒酶催化亞基能否逆轉或者預防抑郁行為，結果意外地發現海馬TERT過 表達后具有抗抑郁作用。

基于以上研究成果，本發明目的之一是提供提高細胞端粒酶活性的方法；

本發明目的之二是提供Ad-mTERT-GFP腺病毒重組載體；

本發明目的之三是提供構建Ad-mTERT-GFP腺病毒重組載體的高效方法；

本發明目的之四是驗證Ad-mTERT-GFP腺病毒重組載體在抑郁癥中的治療作用；

本發明目的之五是闡明Ad-mTERT-GFP腺病毒重組載體抗抑郁作用的途徑。

本發明的第一方面，提供了一種提高細胞端粒酶活性的方法。通過過小鼠端粒酶催 化亞基的表達增加端粒酶活性。其主要設計是將小鼠的mTERT的全長基因導入到重組 腺病毒載體中(Ad-mTERT)，并連接報告基因GFP。通過腺病毒重組載體感染目的細 胞后就可以過表達小鼠的端粒酶催化亞基TERT。這種過表達的原理是：(1)TERT是 端粒酶的核心功能區；(2)表達全長的TERT，保證TERT功能的發揮；(3)引入報道 基因GFP，為藥物臨床前研究和神經生物學的實驗研究提供了標簽，對細胞和組織不產 生影響。

本發明的第二方面，提供了一種過表達TERT基因的載體工具。該載體按照本發明 第一方面所述提高細胞端粒酶活性的方法思路進行設計。具體地，應用pDC315-GFP載 體，導入TERT基因，用腺病毒包裝后具有較高的感染效率和表達效率，不影響TERT 的功能。GFP蛋白具有無毒性和免疫原性的優點，安全性較好。

本發明的第三方面，提供了Ad-mTERT的高效構建方法。首先從胚胎小鼠的海馬體 中，利用RT-PCR的方法釣取mTERT基因，然后將目的基因與目的載體(pDC315-EGFP) 分別進行雙酶切。純化酶切產物后進行定向連接或重組，其產物轉化用氯化鈣制備新鮮 的大腸桿菌感受態細胞，對長出的克隆先進行PCR鑒定，其上下游引物分別設計在載 體和目的基因上(Primer(+):TERE-SEQF:TGAACAGCCTCCAGACAGTC，Primer(-): EGFP-C-R：CGTCGCCGTCCAGCTCGACCAG).PCR鑒定為陽性的克隆，證明目的基 因已經定向連入目的載體。再對PCR鑒定陽性的克隆進行測序和分析比對，比對正確 的即為構建成功的融合蛋白表達質粒載體。將構建好的融合蛋白表達載體進行超純去內 毒素抽提，按Invitrogen公司Lipofectamine2000使用說明轉入293T細胞，36-48h后通 過熒光顯微鏡觀察融合蛋白GFP/RFP，或者通過Western Blot/RT-PCR等檢測方法檢測 目的基因的表達。

本發明的第四方面，驗證特異性過表達mTERT的功能。藥效學實驗結果顯示，用 本發明所述的腺病毒重組載體能夠使TERT表達增加、端粒酶活性增加，刺激神經干細 胞增殖、分化、可塑性，改善小鼠抑郁行為，是一種有效的抗抑郁治療手段。在實驗研 究中，該病毒載體能夠用于涉及的端粒酶的神經生物學研究，提供一種有效的增加端粒 酶功能的工具。具體藥效學試驗過程詳述如下：