[發(fā)明專利]高效表達(dá)重組人β-NGF-Fc融合蛋白的CHO細(xì)胞株及其構(gòu)建方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201710814552.X
• 申請日: 2017-09-12
• 公開（公告）號: CN108300736B
• 公開（公告）日: 2021-05-14
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 饒春明;李永紅;趙韻芽;韓春梅;史新昌;陶磊;段茂芹
• 申請（專利權(quán)）人: 中國食品藥品檢定研究院
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C12N5/10;C07K19/00;C07K1/18;C07K1/16
• 代理公司: 北京中知法苑知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11226
• 代理人: 常玉明;張?zhí)m海

1.高效表達(dá)重組人β-NGF-Fc融合蛋白的CHO細(xì)胞株，其特征在于，所述重組細(xì)胞為分泌表達(dá)重組人β-NGF-Fc融合蛋白的CHO-S細(xì)胞株；其含有重組載體為： pCHO1.0-beta-NGF-opt-Fc，該重組載體核苷酸序列如 SEQ ID NO ：2 所示，所述載體為Freedom^TMpCHO1.0；CHO-S細(xì)胞株在CD Forti CHO 無血清培養(yǎng)基中常規(guī)培養(yǎng)；其為經(jīng)過氨甲喋呤和嘌呤霉素加壓篩選培養(yǎng)后的細(xì)胞。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高效表達(dá)重組人β-NGF-Fc融合蛋白的CHO細(xì)胞株，其特征在于，所述加壓篩選為兩個階段的加壓篩選：第一階段篩選中氨甲喋呤的濃度為100nM ；第二階段篩選中氨甲喋呤的濃度為50nM ；所述第一階段篩選中嘌呤霉素的濃度為10μg/mL ；第二階段篩選中嘌呤霉素的濃度為30μg/mL。

3.權(quán)利要求1 或2所述的任一項(xiàng)的重組細(xì)胞用于制備β-NGF-Fc融合蛋白的用途。

4.權(quán)利要求1或2所述的任一項(xiàng)的重組細(xì)胞的制備方法，其特征在于：包括以下步驟：

（1）將權(quán)利要求1 的重組載體轉(zhuǎn)染入CHO 細(xì)胞中，在含有無血清培養(yǎng)基的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中靜止培養(yǎng)10 ～14 天，所述無血清培養(yǎng)基中氨甲喋呤的濃度為100nM，嘌呤霉素的濃度為10μg/mL ；

（2）將步驟（1）培養(yǎng)獲得的細(xì)胞轉(zhuǎn)移至搖瓶中搖動培養(yǎng)11 ～15 天，每3 ～4 天傳一代，培養(yǎng)基與步驟（1）相同；

（3）繼續(xù)在含有無血清培養(yǎng)基的搖瓶中搖動培養(yǎng)18 ～25 天，每3 ～4 天傳一代，所述無血清培養(yǎng)基中氨甲喋呤的濃度為50nM，嘌呤霉素的濃度為30μg/mL，即獲得權(quán)利要求1-2任一項(xiàng)的重組人β-NGF-Fc融合蛋白的CHO細(xì)胞株。

5.β-NGF-Fc融合蛋白的純化方法，其特征在于，包括以下步驟：

1）培養(yǎng)表達(dá)β-NGF-Fc融合蛋白的如權(quán)利要求1所示的重組細(xì)胞，收獲細(xì)胞培養(yǎng)上清；

2）將細(xì)胞培養(yǎng)上清用離子交換層析進(jìn)行純化，得到純化后的樣品；

3）將步驟2）獲得的樣品用分子篩層析進(jìn)行純化，得到純化的β-NGF-Fc融合蛋白。