[發明專利]一種基于腺病毒AdC6的表達載體及其構建方法

在審

• 申請號: 201710814259.3
• 申請日: 2017-09-11
• 公開（公告）號: CN107686843A
• 公開（公告）日: 2018-02-13
• 發明（設計）人: 李婷婷;羅升學;王文敬;黎誠耀
• 申請（專利權）人: 南方醫科大學
• 主分類號: C12N15/66
• 分類號: C12N15/66;C12N15/861
• 代理公司: 廣州粵高專利商標代理有限公司44102
• 代理人: 鄧義華,廖苑濱

1.一種制備腺病毒表達載體的方法，其特征在于，所述方法包括：

以野生型腺病毒AdC6基因組為基礎，通過基因組直接克隆方法，刪除E1和E3的編碼區，在E1刪除區插入I-Ceu I和PI-Sce I酶切位點，獲得復制缺陷性腺病毒載體。

2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的刪除E1的編碼區是指刪除野生型AdC6基因組中第492-3022位的序列。

3.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的刪除E3的編碼區是指刪除野生型AdC6基因組中第27895-31909位的序列。

4.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述克隆方法包括：

（1）PCR擴增AdC6腺病毒基因組的LITR片段，用PmeI和BatApI酶切pNEB193質粒和PCR產物，連接形成質粒pNEB193-PB；

（2）用SnaBI和NdeI酶切PUC57-linker和pNEB193-PB質粒，連接成質粒Pneb193-PB +linker；

（3）PCR分別擴增AdC6腺病毒基因組從3022位至9022位片段，從9002位至16002位片段和15982位至22000位片段，用NdeI 和MluI酶切質粒Pneb193-PB +linker，通過Takara的快速連接試劑盒連接4個DNA片段，獲得質粒pNEB193-DE1；

（4）PCR分別擴增AdC6腺病毒基因組從21980位至27895位片段和從31909位至36604位DNA片段，用EcoRV和HpaI酶切線性化質粒pNEB193-DE1，通過Takara的快速連接試劑盒連接3個DNA片段，獲得質粒pNEB193-DE1E3。

5.一種腺病毒表達載體，其特征在于，其由權利要求1-4任一項所述方法制備得到。

6.如權利要求5所述的腺病毒表達載體，其特征在于，所述腺病毒表達載體的核苷酸序列如SEQ ID NO：16所示。

7.如權利要求5所述的腺病毒表達載體，其特征在于，所述表達載體的酶切位點I-Ceu I和PI-Sce I之間，還包括外源的抗原基因。

8.如權利要求7所述的腺病毒表達載體，其特征在于，所述的外源的抗原是丙肝病毒的非結構蛋白NS3的抗原。

9.一種制備疫苗的方法，其特征在于，所述方法包括：

（1）提供權利要求5所述的腺病毒表達載體；

（2）將外源的抗原編碼基因插入到（1）表達載體的酶切位點I-Ceu I和PI-Sce I之間；

（3）將（2）的重組表達載體感染病毒包裝細胞，病毒在細胞內包裝，從而獲得具有免疫原性的疫苗。