[發(fā)明專(zhuān)利]一種生物材料的玻璃化凍存方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710811425.4
• 申請(qǐng)日: 2017-09-11
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN109479870A
• 公開(kāi)（公告）日: 2019-03-19
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 段恩奎;雷曉華;曹宇靜;寧立娜;張?jiān)品?/a>
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 中國(guó)科學(xué)院動(dòng)物研究所
• 主分類(lèi)號(hào): A01N1/02
• 分類(lèi)號(hào): A01N1/02
• 代理公司: 北京泛華偉業(yè)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11280
• 代理人: 李渤;郭廣迅

1.一種生物材料的玻璃化凍存方法，所述玻璃化凍存方法包括以下步驟：

1)制備用于生物材料的玻璃化凍存的緩沖液、凍存液；

其中，所述緩沖液為PB1、所述凍存液為EFS20和EFS40；

2)將待保存的生物材料放入緩沖液中靜置，然后轉(zhuǎn)移到EFS20中靜置10-60秒，再轉(zhuǎn)移到EFS40中靜置10-60秒；

優(yōu)選地，在所述緩沖液中靜置的時(shí)間為10-60秒；

優(yōu)選地，在EFS20中靜置的時(shí)間為20-60秒；

優(yōu)選地，在EFS40中靜置的時(shí)間為10-30秒；

3)將EFS40中的生物材料轉(zhuǎn)移到孔徑為30-50μm，優(yōu)選為30-39μm，更優(yōu)選為34-36μm的尼龍纖網(wǎng)片上；

優(yōu)選地，所述尼龍纖網(wǎng)片的尺寸為0.3cm²～0.8cm²；

優(yōu)選地，所述尼龍纖網(wǎng)片具有便于夾取的突起；

優(yōu)選地，每片尼龍纖網(wǎng)片移入1-100枚生物材料；更優(yōu)選地，每片尼龍纖網(wǎng)片移入30-50枚生物材料；

4)將凍存容器浸入液氮中；

5)將步驟3)的尼龍纖網(wǎng)片快速轉(zhuǎn)移到步驟4)的凍存容器中，然后將凍存容器完全浸入液氮中，并蓋上蓋子，放入液氮中長(zhǎng)期保存；

6)在使用時(shí)，將生物材料在解凍液中解凍。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，在步驟1)中，所述PB1緩沖液通過(guò)包括以下步驟的方法制備：

a.分別制備A液、B液和C液

將4.00克氯化鈉、0.1克氯化鉀、0.1克磷酸二氫鉀、0.575克磷酸氫二鈉、0.018克丙酮酸鈉、0.5克葡萄糖、1.5克牛血清白蛋白和0.025克青霉素溶于200ml三蒸超純水中攪拌均勻，即為A液；

將0.0657克二水氯化鈣溶于50ml三蒸超純水中攪拌均勻，即為B液；

將0.05克六水氯化鎂溶于50ml三蒸超純水中攪拌均勻，即為C液；

b.將A液、B液和C液置于4～10℃中0.5-2h至完全溶解；

c.將完全溶解后的A液、B液、C液混合在一起，定容至500毫升，即為PB1緩沖液。

3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，在步驟1)中，所述凍存液EFS20包含以下組分：

PB1緩沖液、20％(V/V)的乙二醇、18％(V/V)的聚蔗糖70(Ficoll-70)、0.3M的蔗糖；

優(yōu)選地，在步驟1)中，所述凍存液EFS40包含以下組分：

PB1緩沖液、40％(V/V)的乙二醇、18％(V/V)的聚蔗糖70(Ficoll-70)、0.3M的蔗糖。

4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，在步驟1)中，所述凍存液EFS20和EFS40通過(guò)包括以下步驟的方法制備：

以PB1緩沖液為基礎(chǔ)液，加入乙二醇使其體積比為20％，加入Ficoll-70使其體積比為18％，并添加蔗糖，使其終濃度為0.3M，充分混勻，溶解過(guò)夜，然后使用0.22μm的濾器過(guò)濾除菌，即配制成EFS20凍存液；

以PB1緩沖液為基礎(chǔ)液，加入乙二醇使其體積比為40％，加入Ficoll-70使其體積比為18％，并添加蔗糖，使其終濃度為0.3M，充分混勻，溶解過(guò)夜，然后使用0.22μm的濾器過(guò)濾除菌，即配制成EFS40凍存液。

5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述解凍液通過(guò)包括以下步驟的方法制備：

以PB1緩沖液為基礎(chǔ)液，加入蔗糖分別配成0.5M、0.25M和0.125M的蔗糖溶液，待蔗糖在PB1緩沖液中充分溶解后，用0.22μm的濾器過(guò)濾除菌，即配制成解凍液。

6.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述解凍包括以下步驟：

首先將尼龍纖網(wǎng)片快速浸入0.5M的蔗糖刷洗3-5次，室溫平衡10-30min；然后將0.5M的蔗糖解凍液中的生物材料移入0.25M的蔗糖解凍液中，平衡10-30min中后再移入0.125M的蔗糖解凍液中，平衡10-30min后，最后移入PB1緩沖液中，即完成胚胎解凍。