[發明專利]一種能在培養基上簡單高效篩選產綠原酸菌株的方法

有效

• 申請號: 201710805566.5
• 申請日: 2017-09-08
• 公開（公告）號: CN107653190B
• 公開（公告）日: 2021-08-17
• 發明（設計）人: 樊憲偉;王曉;陳鑫鑫;李有志
• 申請（專利權）人: 廣西大學
• 主分類號: C12N1/02
• 分類號: C12N1/02
• 代理公司: 南寧市吉昌知識產權代理事務所(普通合伙) 45125
• 代理人: 李秋琦

本發明屬于次級代謝產物?綠原酸研究技術領域，具體涉及一種能在培養基上簡單、快速、高效篩選產綠原酸菌株的方法。本發明選取紅薯、杜仲、金銀花、山茶花、紅腺忍冬、薄荷、腺葉桂櫻等植物作為主要研究對象，利用該方法在不同植物中篩選，共獲得了內生菌11株，其中，能產生綠原酸等次生代謝物10株，篩選效率為91％。此方法與高效液相色譜法對比，具有省時省力、簡單、快速、低成本、高效率等優點。本發明原理可以類推到其他產生次生代謝物菌株的篩選中，應用前景廣泛。

技術領域

本發明屬于次級代謝產物-綠原酸研究技術領域，涉及一種能在培養基上簡單高效篩選產綠原酸菌株的方法。

背景技術

1891年，Kossel明確提出植物次生代謝物的概念，以初生代謝的中間產物作為起始物，釋放能量。植物次生代謝產物種類繁多，結構迥異，根據結構式及其性質主要分為酚類、萜類以及含氮化合物。雖然次生代謝產物并不是細胞生命活動或植物生長發育所必需的，但在植物生長過程中卻有助于提高植物適應外界環境的能力，比如在植物抗病害、抗逆境和抗動物危害等方面發揮著關鍵作用。

綠原酸(Chlorogenic acid，CGA)是植物體有氧呼吸過程中經過莽草酸及苯丙酸途徑產生的重要的次生代謝物，廣泛存在于高等雙子葉植物和蕨類植物中。它是由咖啡酸(Caffeic acid)和奎寧酸(Quinic acid)脫水縮合成3-O- 咖啡酰奎寧酸(3-O-caffeoylquinic acid)，分子式為C₆H₁₈O₉，屬于多酚有機酸。綠原酸的藥效功能突出，主要涉及抗氧化清除自由基，顯著提高谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)和過氧化氫酶(CAT)的活性；抑菌、抗腫瘤，明顯抑制人乳腺癌細胞系(MCF-7)增殖，使細胞停滯于G0/G1期。此外，綠原酸還是一種新型高效抗氧化劑，且抗氧化穩定性強、增香保色效果明顯。因此，在食品行業中已部分取代了人工合成的抗氧化劑及防腐劑。由于綠原酸具有光化學活性，易發生光降解反應，紫外吸收能力強，較多應用在化妝品防曬領域。

鑒于綠原酸在醫藥保健、食品保鮮、日用化工等方面具有的廣泛應用價值，市場對于綠原酸的需求量越來越大，而目前主要從杜仲、金銀花等藥用植物中提取獲得。由于植物中綠原酸含量受植物種類、組織、生產季節、外界環境等條件的影響。因此，綠原酸的生產受到限制性因素較多，產量不穩定。在真菌和細菌中也存在莽草酸途徑，從微生物中篩選高效產綠原酸的菌株，優化條件后采用發酵的方法生產綠原酸是一種具有潛在應用前景的方法。目前，綠原酸的定性定量技術主要包括分光光度法，其操作簡便，對儀器要求低，易受其它結構類似物的干擾，檢測結果不夠準確；薄層－紫外分光光度法，結合顯色劑使綠原酸在特定波長下有熒光吸收，以此定性定量，較好的排除雜質干擾，檢測結果較為準確；高效液相色譜法，其分離效果顯著、線性關系好、檢測極限低、回收率與精密度高，耗費較高；氣相色譜法，靈敏度高，重現性好，但酯化溫度太高，操作繁瑣，費用較高；以上方法適用于少量綠原酸菌株的驗證工作，不適于大量的篩選工作，但從環境中發掘產綠原酸菌株涉及的篩選工作量大、工作耗時多、實驗耗費高，因此，急需開發一種簡單、快速、低成本篩選產綠原酸菌株的方法。

多酚類化合物含有多個酚羥基，具有較強的酸堿緩沖能力，且還原性強，可作為多基配體與金屬離子如Fe³⁺，Al³⁺，Pb²⁺，Cu²⁺等絡合，形成環狀螯合絡合物。綠原酸屬于多酚類化合物，且結構式中存在鄰二酚羥基，理論上可以與金屬離子發生顯色螯合反應。據報道，在酸性土壤中的鋁離子和入侵植物根系分泌的綠原酸形成的復合物能夠抑制其它植物的生長；在堿性條件下，綠原酸與鋁離子形成穩定的紫紅色復合物，并在530nm波長下，產生特征吸收光譜。

基于這幾點，本發明利用綠原酸特殊化學結構，根據特有基團之間的反應設計和選擇新的培養基配方，使其可以直接在培養基上進行顯色篩選，提高篩選效率。

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