[發明專利]用于抑制HSV-1復制和/或靶標序列表達的CRISPR/Cas9系統、方法、試劑盒及其應用

在審

• 申請號: 201710804003.4
• 申請日: 2017-09-08
• 公開（公告）號: CN109468319A
• 公開（公告）日: 2019-03-15
• 發明（設計）人: 黃軍就;松陽洲;陳昱僖;支勝堯;梁普平
• 申請（專利權）人: 中山大學
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N5/10;C12N15/90;A61K48/00;A61P31/22
• 代理公司: 廣州市南鋒專利事務所有限公司 44228
• 代理人: 張小黎

本發明提供了用于抑制HSV?1復制和/或靶標序列表達的CRISPR/Cas9系統，包含Cas9蛋白和gRNA，所述gRNA的編碼序列包括SEQ ID NO.1?SEQ ID NO.6所示核苷酸序列中的一種或多種。本發明還提供了用于抑制HSV?1復制和/或靶標序列表達的組合物、試劑盒。本發明采用的Cas9CRISPR/Cas9系統可有效抑制HSV?1病毒復制、抑制HSV?1病毒的靶標序列的表達，還可應用于治療HSV?1病毒感染或HSV?1病毒誘導的癌癥。

技術領域

本發明涉及基因治療領域，涉及一種用于抑制HSV-1復制和/或靶標序列表達的CRISPR/Cas9系統、方法、試劑盒及其應用。

背景技術

單純皰疹病毒(Herpes simplex viruses，HSV)是具有包膜的雙鏈DNA病毒，病毒基因組包含74個與病毒增殖感染相關的基因，可分為兩種血清型HSV-1和HSV-2。HSV-1可在人群中傳染，其中三分之一感染人口會發生復發感染。單純皰疹病毒性角膜炎是導致角膜盲的最主要原因，每年全球大約有一百五十萬人口患單純皰疹性角膜炎。

HSV-1原發感染后病毒可能潛伏于體內神經細胞中，病毒受刺激再次激活會發生單純皰疹病毒繼發感染。在繼發感染中，潛伏病毒通過神經軸運輸至皮膚，病毒復制使上皮細胞死亡脫落，形成新的發病灶。單純皰疹病毒性角膜炎是由HSV-1在角膜上繼發感染引起的其中一種疾病，是臨床上最為常見的病毒性角膜炎之一，同時是引起角膜盲的最主要因素。潛伏感染的HSV-1將自身基因組藏匿于神經細胞內，只表達潛伏期相關RNA(latencyassociated transcript，LAT)。病毒增殖和感染相關的蛋白在潛伏期不表達，一方面對機體產生免疫逃逸，另一方面主流抗病毒藥物也失去作用靶點，不能清除潛伏的HSV-1。這導致了病毒性角膜炎難以根治的問題。

規律成簇間隔短回文重復系統(clustered regularly interspaced shortpalindromic repeat；CRISPR-associated，CRISPR-Cas)是古菌和細菌的抵抗病毒和質粒侵染的重要免疫防御系統，用來抵抗外源遺傳物質的入侵，比如噬菌體病毒和外源質粒。同時，它為細菌提供了獲得性免疫：這與哺乳動物的獲得性免疫類似，當細菌遭受病毒或者外源質粒入侵時，會產生相應的“記憶”，從而可以抵抗它們的再次入侵。CRISPR/Cas系統可以識別出外源DNA或RNA，并將它們切斷，沉默外源基因的表達。

CRISPR-Cas系統劃分為兩大類，第一大類CRISPR-Cas系統由多亞基組成的效應復合物發揮功能；第二大類是由單個效應蛋白(如Cas9,Cpf1,C2c1等)來發揮功能。其中，Cas9,Cpf1,C2c1均具有RNA介導的DNA核酸內切酶活性。

在自然界中，CRISPR/Cas系統擁有多種類別，其中CRISPR/Cas9系統是研究最深入，應用最成熟的一種類別。CRISPR-Cas9是一種具有核酸內切酶活性的復合體，識別特定的DNA序列，進行特定位點切割造成雙鏈DNA斷裂(Double-strand breaks,DSB)，在沒有模板的條件下，發生非同源重組末端連接(Non-homologous end joining,NHEJ)，造成移碼突變(frameshift mutation)，導致基因敲除。CRISPR/Cas9是繼“鋅指核酸內切酶(ZFN)”、“類轉錄激活因子效應物核酸酶(TALEN)”之后出現的第三代“基因組定點編輯技術”。憑借著成本低廉，操作方便，效率高等優點，CRISPR/Cas9迅速風靡全球的實驗室，成為了生物科研的有力幫手。

近兩年，研究界開始嘗試將Cas9CRISPR/Cas9系統應用于抑制HSV-1復制和/或靶標序列表達，但是由于gRNA的實際應用效果受多種因素影響，能有效從病毒基因組層面抑制HSV-1增殖和復制的gRNA報道并不多。

因此，有必要提供一種用于抑制HSV-1復制和/或靶標序列表達的CRISPR/Cas9系統、方法、試劑盒及其應用。