[發明專利]使用CRISPR技術敲除miR-3187-3p在冠狀動脈粥樣硬化性心臟病中的應用

有效

• 申請號: 201710796805.5
• 申請日: 2017-09-06
• 公開（公告）號: CN107519492B
• 公開（公告）日: 2019-01-25
• 發明（設計）人: 侯冬雪;萬埝
• 申請（專利權）人: 武漢邁特維爾生物科技有限公司
• 主分類號: A61K45/00
• 分類號: A61K45/00;A61K48/00;A61P9/10
• 代理公司: 東莞市神州眾達專利商標事務所(普通合伙) 44251
• 代理人: 陳世洪

本發明提供一種利用CRISPR?Cas9特異敲除miR?3187?3p基因的方法，所述方法為：（1)構建Cas9表達載體；(2構建sgRNA表達載體;(3)將Cas9、sgRNA?混合成混合液，注射哺乳類動物受精卵，實現將miR?3187?3p基因定點敲除的目的。

技術領域

本發明涉及CRISPR技術在冠狀動脈粥樣硬化性心臟病中的應用，屬于醫藥生物技術領域。

背景技術

冠狀動脈粥樣硬化性心臟病是冠狀動脈血管發生動脈粥樣硬化病變而引起血管腔狹窄或阻塞，造成心肌缺血、缺氧或壞死而導致的心臟病，常常被稱為“冠心病”。但是冠心病的范圍可能更廣泛，還包括炎癥、栓塞等導致管腔狹窄或閉塞。世界衛生組織將冠心病分為5大類：無癥狀心肌缺血(隱匿性冠心病)、心絞痛、心肌梗死、缺血性心力衰竭(缺血性心臟病)和猝死5種臨床類型。臨床中常常分為穩定性冠心病和急性冠狀動脈綜合征。

在臨床表現上主要體現在典型胸痛。因體力活動、情緒激動等誘發，突感心前區疼痛，多為發作性絞痛或壓榨痛，也可為憋悶感。疼痛從胸骨后或心前區開始，向上放射至左肩、臂，甚至小指和無名指，休息或含服硝酸甘油可緩解。胸痛放散的部位也可涉及頸部、下頜、牙齒、腹部等。胸痛也可出現在安靜狀態下或夜間，由冠脈痙攣所致，也稱變異型心絞痛。如胸痛性質發生變化，如新近出現的進行性胸痛，痛閾逐步下降，以至稍事體力活動或情緒激動甚至休息或熟睡時亦可發作。疼痛逐漸加劇、變頻，持續時間延長，祛除誘因或含服硝酸甘油不能緩解，此時往往懷疑不穩定心絞痛。

目前，治療冠狀動脈粥樣硬化性心臟病主要使用抗心絞痛藥物，比如硝酸酯類，腎上腺素β受體阻斷藥，鈣通道阻滯劑等。CN105816722A中公開了一種治療冠狀動脈粥樣硬化性心臟病的中藥制劑，其原料藥包括川芎、桃仁、紅花、赤芍、當歸、土鱉蟲、九香蟲、川牛膝、紅曲、生山楂、雄黑豆、穿山甲、延胡索、醋香附、銀杏葉、降香、茯神、遠志、烏棗、甘松、琥珀、五爪龍、柴胡、葛根、桔梗、烏賊魚墨囊。該中藥制劑針對病因病機組方用藥，具有辨證論治的優勢，克服了傳統西藥無法區分證型進行對證治療，通過中藥的內服，可以在一定程度上替代西藥的使用，降低藥物依賴性及副作用等。CN 101332246 B中公開了治療冠心病和心絞痛的中藥制劑，主要包括丹參18-22、三七4-6、赤芍17-23、降香13-18、元胡13-18、紅花7-11、何首烏18-22、雞血藤25-35、沒藥18-22、人參13-17、肉桂13-17、淫羊藿18-22、鹿茸4-6、靈芝11-15、冬蟲夏草7-9、川芎12-18、桃仁8-12、乳香13-17、全蝎4-6、蜈蚣4-6、丹皮12-17等組分，根據實驗結果來看具有一定的效果。

在現有技術中，CN 103877576 B中公開了以Card3基因敲除小鼠和心臟特異性Card3轉基因小鼠為對象，通過阻斷小鼠心臟左冠狀動脈前降支造成心肌梗死模型進行研究，結果表明與WT小鼠對比，Card3基因敲除小鼠心臟梗死比例、心肌肥厚和纖維化的程度明顯被抑制，心功能明顯好轉；CN 103893743 B中以GDF1基因敲除小鼠和心臟特異性GDF1轉基因小鼠為實驗對象，通過阻斷小鼠心臟左冠狀動脈前降支造成心肌梗死模型進行研究，結果表明與MEM-Cre對照小鼠對比，GDF1基因敲除小鼠心臟梗死比例、心肌肥厚和纖維化的程度明顯增加，心功能明顯惡化；而心臟特異性GDF1轉基因小鼠的心臟梗死比例、心肌肥厚和纖維化的程度明顯被抑制，心功能明顯改善。CN 103898189 B中公開了以SHPS-1基因敲除小鼠和心臟特異性SHPS-1轉基因小鼠為實驗對象，通過阻斷小鼠心臟左冠狀動脈前降支(LAD)造成心肌梗死模型，結果表明與WT對照小鼠對比，SHPS-1基因敲除小鼠在MI術后心臟梗死比例、心肌肥厚和纖維化的程度明顯被抑制，心功能明顯好轉；CN 103893763 B中公開了以Vinexin-β基因敲除小鼠和心臟特異性Vinexin-β轉基因小鼠為實驗對象，通過阻斷小鼠心臟左冠狀動脈前降支(LAD)造成心肌梗死模型，結果表明與WT對照小鼠對比，Vinexin-β基因敲除小鼠在MI術后心臟梗死比例、心肌肥厚和纖維化的程度明顯被抑制，心功能明顯好轉。通過以上結果可以發現，通過基因干擾可以實現冠狀動脈粥樣硬化性心臟病的治療。