[發明專利]雜交瘤細胞株4A5及燦爛弧菌鞭毛蛋白FlgT單克隆抗體

在審

• 申請號: 201710796788.5
• 申請日: 2017-09-06
• 公開（公告）號: CN107723277A
• 公開（公告）日: 2018-02-23
• 發明（設計）人: 李強;黎睿君;于子超;王博雅;葉仕根
• 申請（專利權）人: 大連海洋大學
• 主分類號: C12N5/20
• 分類號: C12N5/20;C07K16/12
• 代理公司: 大連非凡專利事務所21220
• 代理人: 閃紅霞

技術領域

本發明涉及一種雜交瘤細胞株及單克隆抗體，尤其是一種雜交瘤細胞株4A5及燦爛弧菌鞭毛蛋白FlgT 單克隆抗體。

背景技術

燦爛弧菌隸屬于屬弧菌科（Vibrionaceae），是刺參（Apostichopus japonicus）養殖中極為常見的刺參化皮病（腐皮綜合征）的主要致病菌。該病傳染性強、傳播范圍廣，能引起刺參發生大面積的體表潰瘍、口腫潰爛、身體萎縮、排臟等癥狀。此外，燦爛弧菌也能導致多種魚類、雙殼貝類、甲殼類和棘皮動物發病甚至死亡，使被感染的魚體兩側，特別是靠近尾部處出現出血點，導致皮膚腐爛，形成潰瘍，背鰭、胸鰭、尾鰭的鰭條基部充血，腎臟、肝臟糜爛等癥狀。因此，檢測燦爛弧菌意義重大。目前，針對細菌的檢測方法主要有傳統的微生物學檢測技術（平板培養法）、分子生物學方法及免疫學檢測方法。平板培養法是操作相對簡單，但過程復雜，耗時較長；分子生物學檢測方法靈敏度高、特異性強，但需要特殊的儀器設備和專業人員，達不到快速、現場檢測的目的，不適合在基層推廣使用。免疫學檢測方法具有操作相對簡單、靈敏度高、檢測時間短、處理樣品多等特點，但是需要具有特異性強的抗體或抗原。現有燦爛弧菌單抗（單克隆抗體）是采用燦爛弧菌全菌制備的雜交瘤細胞株所分泌，特異性較差，難以應用于免疫學檢測。

FlgT是組成燦爛弧菌鞭毛蛋白中H環所不可缺少的結構蛋白，全長254個氨基酸，分子量大小約為30 KDa。FlgT對維持正常的鞭毛功能有著重要的作用，當缺少FlgT 時，定子的正確裝配以及鞭毛的運動功能都會受到影響。但是，迄今為止，并沒有以FlgT蛋白制備分泌燦爛弧菌鞭毛蛋白FlgT 單克隆抗體的雜交瘤細胞株的相關報道。

發明內容

本發明是為了解決現有技術所存在的上述技術問題，提供一種雜交瘤細胞株4A5及燦爛弧菌鞭毛蛋白FlgT 單克隆抗體。

本發明的技術解決方案是：一種雜交瘤細胞株4A5，已保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號：CGMCC No. 14311。

一種燦爛弧菌鞭毛蛋白FlgT 單克隆抗體，是雜交瘤細胞株4A5分泌的。

本發明是利用重組蛋白FlgT作為抗原免疫小鼠，取小鼠脾臟細胞與SP2/0 細胞進行融合，有限稀釋法獲得單克隆，ELISA 法篩選陽性雜交瘤細胞，獲得能分泌抗燦爛弧菌鞭毛蛋白FlgT單克隆抗體的雜交瘤細胞株，命名為4A5，所分泌的抗燦爛弧菌鞭毛蛋白FlgT單克隆抗體更具有特異性，可應用于燦爛弧菌的免疫檢測。

分泌燦爛弧菌鞭毛蛋白FlgT 單克隆抗體的雜交瘤細胞株4A5雜保藏日期：2017年7月5日；

分類命名：抗燦爛弧菌鞭毛蛋白FlgT 單克隆抗體的雜交瘤細胞株；

保藏單位：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心（CGMCC）；

保藏單位地址：北京市朝陽區北辰西路1號院3號

保藏號：CGMCC No. 14311。

具體實施方式

本發明的雜交瘤細胞株4A5，已保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號：CGMCC No. 14311。雜交瘤細胞株4A5分泌燦爛弧菌鞭毛蛋白FlgT單克隆抗體。

雜交瘤細胞株4A5制備方法如下：

1. 制備免疫抗原

（1）重組表達載體的構建：根據FlgT 核苷酸序列（FlgT 核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示，762 bp) 設計引物進行PCR 擴增，基因兩側分別引入限制性內切酶位點SgfI 和MluI ，插入表達載體pET-22b T7啟動子下游，構建FlgT 重組表達質粒；

（2）FlgT 重組蛋白的表達與純化：以 E. coli BL21菌株為表達菌株，將FlgT重組表達質粒轉入表達菌株中進行FlgT 重組表達。裂解離心取沉淀，經過包涵體復性及純化，獲得純化的FlgT 重組蛋白，即免疫抗原。

2. 制備雜交瘤細胞株：采用免疫抗原免疫BALB/c 小鼠，取小鼠脾臟細胞與SP2/0 細胞進行融合，有限稀釋法獲得單克隆，ELISA 法篩選陽性雜交瘤細胞，獲得能分泌抗燦爛弧菌鞭毛蛋白FlgT 單克隆抗體的雜交瘤細胞株，命名為4A5。

具體方法如下：

1. 制備免疫抗原

1.1 燦爛弧菌鞭毛蛋白FlgT 的表達

原核表達載體pET-22b T7 的構建：

以燦爛弧菌JZ6 基因組為模板，設計引物并通過PCR 擴增后，得到FlgT 基因；具體過程如下：