[發明專利]一種基于代謝組學的殺菌劑作用機制研究方法

在審

• 申請號: 201710796515.0
• 申請日: 2017-09-06
• 公開（公告）號: CN107796884A
• 公開（公告）日: 2018-03-13
• 發明（設計）人: 劉鵬飛;胡志宏;母丹;任紀龍;代探;梁莉;劉盼晴;劉西莉
• 申請（專利權）人: 中國農業大學
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02;G01N30/06;G01N30/72
• 代理公司: 北京路浩知識產權代理有限公司11002
• 代理人: 王文君,黃爽

1.一種基于代謝組學的殺菌劑作用機制研究方法，其特征在于，基于GC-MS技術對含殺菌劑和無藥對照培養基上培養的病原菌菌絲進行代謝組檢測，通過比較代謝組學研究法尋找差異代謝物，排除不同作用機制共有的代謝物，獲得目標殺菌劑作用機制的特異性生物標志物，利用生物標志物含量的變化來實現對殺菌劑作用機制的識別及高通量分析；

其中，所述病原菌包括病原真菌和病原卵菌。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，包括以下步驟：

S1、菌絲培養、收集、滅活和保存；

S2、代謝組樣品前處理和GC-MS檢測；

S3、利用比較代謝組尋找生物標志物。

3.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，步驟S1具體如下：

將病原菌的菌絲于固體培養基上于18～37℃培養～1～7d，菌落外緣沿同心圓打取菌餅，接至鋪有玻璃紙的含有抑制菌絲生長20％～80％濃度殺菌劑的培養基平板上，對照組添加等量有機溶劑；用刮刀刮取玻璃紙上的菌絲培養物，去除接種的菌餅，收集至離心管中；將裝有菌絲的離心管置于液氮中速凍3～5min滅活，獲得的菌絲樣品置于-80℃冰箱保存；

其中，所述固體培養基包括馬鈴薯葡萄糖瓊脂PDA、V8A、酵母葡萄糖瓊脂YGA、胡蘿卜瓊脂CA或燕麥粉瓊脂培養基OA；

所述有機溶劑選自二甲基亞砜、甲醇、丙酮中的至少一種。

4.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，步驟S2具體如下：

S21、冷凍干燥及研磨破碎：滅活后的菌絲冷凍干燥后研磨，或采用球磨儀研磨破碎處理，得菌絲粉末；

S22、代謝物提取：稱取30.0±0.2mg的菌絲粉末，加入1.8mL溶解0.1～100μg/mL內標物質的提取溶劑，采用渦旋振蕩1min后，繼續超聲提取20min；

S23、離心干燥：將步驟S22中提取獲得的代謝物溶液在4000～12000r/min下離心5～15min，棄去沉淀，得代謝物提取液；取0.6mL代謝物提取液至0.6mL離心管中，45℃抽真空離心干燥4～8h，直至質量恒定；

S24、衍生化：包括肟化或腙化以及三甲基硅烷化兩步衍生化反應；

S25、GC-MS檢測：采用HP-5MS毛細管柱，規格30m×0.25mm×0.25μm；進樣體積1μL；流速1mL/min；程序升溫；離子源溫度為230～300℃，傳輸線溫度為230～300℃；氦氣為載氣，恒流模式；采用EI電離源，全掃描掃描范圍m/z 20～650，頻率0.2s/scan；溶劑延遲時間5.9min。

5.根據權利要求4所述的方法，其特征在于，步驟S22中所述提取溶劑為甲醇和水混合溶液，甲醇與水的體積比為9.5:0.5-5:5；所述內標物質為水楊苷。

6.根據權利要求4所述的方法，其特征在于，步驟S24衍生化的操作步驟如下：

1)取100μL衍生化試劑1加入已離心干燥好的樣品管中，封口，超聲20min，渦旋1min溶解，稍微離心后30℃條件下進行肟化或腙化衍生化反應2h；

2)加入100μL的衍生化試劑2至樣品管中，封口，超聲20min，渦旋1min溶解，稍微離心，37℃條件下進行硅烷化衍生反應4～10h；

3)衍生化獲得的樣品在轉速10000～15000r/min下離心15min，吸取上清液至GC樣品玻璃管中，獲得用于GC-MS檢測的病原菌菌絲代謝物樣品；

其中，步驟1)所述衍生化試劑1為甲氧基胺鹽酸鹽溶解于吡啶獲得的溶液，濃度為10～40mg/mL；步驟2)所述衍生化試劑2選自三甲基氯硅烷、N,O-雙三甲硅基乙酰胺、三甲基咪唑、N，O-雙三甲硅基三氟乙酰胺、N-甲基-N-三甲硅基三氟乙酰胺、六甲基二硅胺烷、N-甲基-N-三甲硅基乙酰胺中的至少一種。