[發明專利]一種成熟脂肪細胞去分化培養的裝置及方法

在審

• 申請號: 201710795740.2
• 申請日: 2017-09-06
• 公開（公告）號: CN107345205A
• 公開（公告）日: 2017-11-14
• 發明（設計）人: 屈長青;劉佳;姬云濤;李孝麗;岳少云;孫晶晶
• 申請（專利權）人: 阜陽師范學院
• 主分類號: C12M3/04
• 分類號: C12M3/04;C12M1/22;C12N5/077
• 代理公司: 北京高沃律師事務所11569
• 代理人: 劉奇

技術領域

本發明涉及細胞生物學技術領域，具體涉及一種成熟脂肪細胞去分化培養的裝置及方法。

背景技術

脂肪細胞的數量和體積不僅直接影響家畜的肉品質，更與人類的健康密切相關，由肥胖引起的糖尿病、高血壓、動脈粥樣硬化等疾病已成為危害人類健康的主要殺手，對人類的生存和發展造成巨大威脅，因此研究脂肪細胞的增殖和分化的分子機理具有重要意義。眾所周知，脂肪細胞的分化起始于中胚層多潛能干細胞，經過前體脂肪細胞(脂肪母細胞、前脂肪細胞和不成熟脂肪細胞3個階段)逐漸發育為成熟脂肪細胞。一直以來，人們認為成熟脂肪細胞是一種終末分化的細胞，不具有分裂增殖能力和利用價值。然而，近年來的研究發現，當成熟脂肪細胞用天花板方法培養時，其表型會發生逆轉，自發去分化為具有增殖能力的DFAT細胞，并且這種細胞體外可向多個方向分化，包括成脂、成軟骨、成骨、成肌、成神經和成血管等。同時，由于去分化脂肪(DFAT)細胞比骨髓來源間充質干細胞更容易獲得，比脂肪來源基質細胞純度更高，DFAT細胞已成為組織工程理想的細胞來源，并已在多個動物模型上取得研究成果。因此，將成熟脂肪細胞在體外更好的培養到去分化狀態的DFAT細胞成為目前研究的新的發展方向。

針對于此，現已有發明利用成熟脂肪細胞具有浮力，而去分化后的脂肪細胞恢復其貼壁能力的特點在培養瓶中對其進行去分化培養，稱為“天花板”法。該法培養成熟脂肪細胞去分化雖然操作簡單但是耗費較大，需要將整個培養瓶都充滿細胞培養液，容易造成浪費而且不利于細胞培養過程中培養瓶內外的氣體交換，不利于細胞的生長，且操作過程中容易出現漏液，加大了細胞污染的危險。

發明內容

本發明的目的在于提供一種成熟脂肪細胞去分化培養的裝置及方法。本發明提供的裝置培養成本低、細胞污染率低、操作方便，細胞生長好，有利于后期實驗的開展。

本發明提供了一種成熟脂肪細胞去分化培養的裝置，包括培養皿(1)、皿蓋(2)和離體設置的敞口小室(3)；所述小室在脂肪細胞貼壁培養階段使用時倒置于培養皿中且能夠完全沒入培養皿中，在脂肪細胞貼壁增殖培養階段使用時，與培養皿離體正置放置。

本發明還提供了一種基于上述技術方案所述裝置的成熟脂肪細胞去分化培養方法，包括以下步驟：

將成熟脂肪細胞液加入到培養皿中，再將小室倒置于培養皿中，使小室中充滿成熟脂肪細胞液，倒置進行脂肪細胞貼壁培養6～7天，待50～60％的細胞貼于小室上壁，將小室正置，去掉培養皿，皿蓋蓋于小室上進行貼壁增殖培養3～7天，得到去分化脂肪細胞。

優選的是，所述成熟脂肪細胞液的制備方法包括以下步驟：

將脂肪細胞剪碎，加入質量濃度為0.25％的胰蛋白酶消化液進行消化，所述消化后用含體積濃度為20％胎牛血清的DMEM培養基終止消化，得到消化細胞液；

用孔徑為250μm的尼龍網篩過濾所述消化細胞液，將過濾得到的細胞液在1200r/min轉速下離心10min，棄沉淀，離心得到的頂層懸浮液為成熟脂肪細胞液。

優選的是，所述質量濃度為0.25％的胰蛋白消化液的體積與脂肪細胞的質量比為(0.5～1)mL：1g。

優選的是，所述脂肪細胞貼壁增殖培養過程中每2d換液一次。

優選的是，換液用培養基為含體積濃度20％胎牛血清的DMEM培養基。

優選的是，所述整個培養過程的條件為：37℃，5％CO₂。

本發明提供了一種成熟脂肪細胞去分化培養的裝置。本發明所述裝置將小室倒置于培養皿中，小室的頂部代替了培養瓶的“天花板”，有效地減少了利用“天花板”法培養成熟脂肪細胞去分化時培養液的使用量，既達到了誘導成熟脂肪去分化的效果又避免了不必要的浪費。同時，由于培養過程中培養皿內培養液不會充滿整個細胞培養皿，因此也就避免了阻礙裝置內外氣體的交換；整個裝置為半封閉裝置，細胞在培養的過程中不會直接與空氣接觸，操作過程中也不會出現漏液等現象，有效的防止了細胞污染；且倒置的小室能夠置于培養皿中，當細胞貼壁后，取出再正置培養，這樣便解決了換液和傳代過程中的操作不便的問題。

附圖說明

圖1為本發明提供的成熟脂肪細胞去分化培養的裝置結構圖；

圖2為本發明提供的成熟脂肪細胞去分化培養裝置培養細胞示意圖；

圖3為本發明提供的成熟脂肪細胞去分化培養原理圖；

圖4為本發明實施例1提供的成熟脂肪細胞去分化培養流程圖。

具體實施方式