[發(fā)明專利]一種微衛(wèi)星不穩(wěn)定位點(diǎn)組合、檢測(cè)試劑盒及其應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710795389.7
• 申請(qǐng)日: 2017-09-06
• 公開（公告）號(hào): CN107513565B
• 公開（公告）日: 2018-08-24
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 邵陽(yáng);馬驤原;吳雪;趙忞超;汪笑男;張憲;那成龍;包華;歐秋翔
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 南京世和基因生物技術(shù)有限公司
• 主分類號(hào): C12Q1/6886
• 分類號(hào): C12Q1/6886;C12N15/11;G06F19/18
• 代理公司: 南京正聯(lián)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 32243
• 代理人: 鄧唯

本發(fā)明提供一種微衛(wèi)星不穩(wěn)定位點(diǎn)組合、檢測(cè)試劑盒及其應(yīng)用。通過所使用的微衛(wèi)星不穩(wěn)定性位點(diǎn)的組合，通過下一代測(cè)序技術(shù)（NGS）的檢測(cè)后，可以生成的關(guān)于一個(gè)或多個(gè)能夠指示MSI狀態(tài)的微衛(wèi)星位點(diǎn)的測(cè)序結(jié)果作為輸入數(shù)據(jù)。本方法可以準(zhǔn)確界定MSI狀態(tài)為高、低、或穩(wěn)定，較已有分析方法具有高靈敏性，特異性，及可重復(fù)性的特點(diǎn)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及基因檢測(cè)領(lǐng)域，具體而言，本發(fā)明涉及一種基于下一代測(cè)序技術(shù)(NGS)針對(duì)微衛(wèi)星不穩(wěn)定性(MSI)指示位點(diǎn)的檢測(cè)結(jié)果的分析方法。該方法適用于同時(shí)分析一個(gè)或多個(gè)指示MSI狀態(tài)的微衛(wèi)星位點(diǎn)，準(zhǔn)確評(píng)估病人的MSI狀態(tài)，為腫瘤的診斷、預(yù)后、及臨床治療方案的制定提供理論基礎(chǔ)及指導(dǎo)。

背景技術(shù)

微衛(wèi)星不穩(wěn)定性(Micro-Satellite Instability,或MSI)是一種分子表現(xiàn)型，具體體現(xiàn)為人類基因組內(nèi)微衛(wèi)星位點(diǎn)的重復(fù)序列上存在插入或缺失突變，進(jìn)而產(chǎn)生人類標(biāo)準(zhǔn)基因組中不存在的等位基因。這些插入或缺失因多種原因未被DNA錯(cuò)配修復(fù)機(jī)制(MMR)修正。MSI現(xiàn)象最早于1993年由Aaltonen等在遺傳性非息肉病性大腸癌(HNPCC，亦稱Lynch綜合征)中發(fā)現(xiàn)。產(chǎn)生Lynch綜合征的常見機(jī)理為MLH1、MSH2、MSH6、PMS2、或EPCAM等基因中存在種系失活或截短突變。隨后，研究者相繼在肺癌、消化道癌、子宮內(nèi)膜癌、和卵巢癌中發(fā)現(xiàn)偶發(fā)MSI現(xiàn)象。與Lynch綜合征不同，造成偶發(fā)MSI現(xiàn)象的成因多為MLH1基因啟動(dòng)子序列存在異常的表觀生物學(xué)修飾(過度甲基化)，進(jìn)而導(dǎo)致MLH1基因失活。MSI現(xiàn)象在不同癌種中發(fā)生率亦存在顯著差異，約15％的結(jié)直腸癌患者表現(xiàn)為MSI瘤，而早發(fā)型結(jié)直腸癌中則達(dá)到30％，HNPCC中MSI瘤的發(fā)生率甚至超過90％。

研究顯示，高頻MSI(MSI-H)的二/三期腸癌患者預(yù)后較好，而無法從氟尿嘧啶類藥物(例如5-FU)輔助化療中獲益；但低頻MSI(MSI-L)癌癥患者表征與微衛(wèi)星穩(wěn)定(MSS)癌癥患者相似，預(yù)后較MSI-H患者差。因此，在2011年國(guó)際腫瘤綜合網(wǎng)絡(luò)結(jié)直腸癌篩查指南中正式將MSI檢測(cè)作為首要檢測(cè)項(xiàng)目，其中認(rèn)為以下人群應(yīng)該接受MSI檢測(cè)：

-50歲以下，診斷出結(jié)直腸癌的病人

-病人帶有同時(shí)或異時(shí)性HNPCC類腫瘤，無論年齡。

-病人有一位或多位一級(jí)親屬被診斷為HNPCC腫瘤，且其中至少有一位小于50歲。

-病人有兩位或以上一級(jí)或二級(jí)親屬被診斷出HNPCC類腫瘤，無論年齡。

近期研究表明，MSI檢測(cè)在腫瘤免疫治療中也起到了重要的指導(dǎo)作用。多項(xiàng)研究顯示MSI-H較MSI-L和MSS的結(jié)腸患者接受PD-1抗體治療后效果更好，并陸續(xù)在其他癌種中得到驗(yàn)證。2017年5月，美國(guó)FDA加速批準(zhǔn)了免疫治療藥物Pembrolizumab(Keytruda)用于具有MSI-H或DNA錯(cuò)配修復(fù)缺陷的不可手術(shù)或晚期轉(zhuǎn)移，并在之前的治療后出現(xiàn)進(jìn)展的實(shí)體瘤患者的治療。這也是美國(guó)FDA批準(zhǔn)的首款不依照腫瘤來源的治療方法。可見，準(zhǔn)確界定MSI狀態(tài)對(duì)臨床診斷及治療方案制定具有極高價(jià)值和指導(dǎo)意義。

常用的MSI檢測(cè)主要使用以下三大類技術(shù)：

1.DNA錯(cuò)配修復(fù)缺陷檢測(cè)：直接對(duì)導(dǎo)致MSI現(xiàn)象的相關(guān)基因，主要是DNA錯(cuò)配修復(fù)系統(tǒng)(MMR)基因進(jìn)行基因突變檢測(cè)，或?qū)ζ浔磉_(dá)的蛋白水平運(yùn)用免疫組化的方法進(jìn)行檢測(cè)。

2.PCR檢測(cè)(MSI-PCR):使用特異的引物，對(duì)微衛(wèi)星位點(diǎn)進(jìn)行逐一PCR或多重?zé)晒釶CR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)過凝膠電泳顯像或Sanger片段大小分析其產(chǎn)物片段與正常對(duì)照相比，有無遷移率的改變，從而判定MSI的狀態(tài)。