[發明專利]鹽生草HgNHX基因啟動子序列及其應用

有效

• 申請號: 201710793622.8
• 申請日: 2017-09-06
• 公開（公告）號: CN107446926B
• 公開（公告）日: 2020-12-01
• 發明（設計）人: 汪軍成;王化俊;鄒蘭;李葆春;孟亞雄;馬小樂;姚立蓉;司二靜;任盼榮;楊軻;徐先良;張燕
• 申請（專利權）人: 甘肅農業大學
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N15/10;C12N15/82;A01H5/00;A01H6/20
• 代理公司: 蘭州振華專利代理有限責任公司 62102
• 代理人: 張真

本發明公開了鹽生草HgNHX基因啟動子序列及其應用。以HgNHX基因編碼區5’端上游的1527bp的核苷酸序列作為全長啟動子，設計4對不同的上游及下游引物，通過PCR擴增獲得4個長度各異的啟動子片段，序列除了核心啟動子元件，還包含響應逆境脅迫誘導和植物激素誘導的功能元件。分別與GUS報告基因融合，重組后的表達載體轉化擬南芥，并對陽性克隆植株不同組織、不同發育時期進行GUS染色檢測，確定HgNHX基因啟動子能夠在轉基因植株中行使正常功能，具有組成型啟動子特性。本發明的啟動子對于植物表達載體構建提供了合適的調控元件，對抗逆轉基因育種具有重要的應用價值。

技術領域

本發明屬于植物生物技術領域，具體涉及一種鹽生植物HgNHX(鹽生草液泡膜Na⁺/H⁺反轉運體)基因啟動子序列克隆及其應用。

背景技術

啟動子為位于相應調控基因5'端上游區域，是調控基因轉錄的中心，與RNA聚合酶識別及結合后開啟基因的轉錄過程，包含多種能與轉錄因子相結合的順式作用元件，可參與調控下游相應基因的表達，使的植物能夠有效調控生長發育和應對外界環境的變化。植物中的啟動子主要分為組成型啟動子、組織特異性啟動子和誘導型啟動子三種類別。各類別啟動子啟動的基因表達特性呈現多樣性，且存在明顯的種屬差異性，植物中有些基因的啟動子并不只屬于其中一種類別，有時會表現出其他類別啟動子的特性。

當前，隨著分子生物學技術的迅速發展和轉基因技術手段的逐步完善，使得通過轉基因手段提高植物(作物)產量、品質和對逆境脅迫的適應能力成為現實。雖然優異外源基因的獲得在很大程度上促進了轉基因育種的發展，但如何提高外源基因在轉基因植株中的表達量及組織表達特異性也嚴重制約了轉基因技術的應用價值與范圍，究其主要原因在于優良基因啟動子的缺乏，如當前轉基因技術中，組成型啟動子仍主要以CaMV35S 為主。因此，發掘植物中新的啟動子，并對其功能進行研究，對植物轉基因技術的發展具有重要的經濟價值和應用價值。

鹽生草(Halogeton glomeratus)作為我國西北旱區特有鹽生植物，其主要的耐鹽特性在于肉質化葉片的鹽分液泡區隔化。一般認為NHX(液泡膜Na⁺/H⁺反轉運體)基因是負責鹽分液泡區隔化的主要轉運體，因此，位于鹽生草NHX基因上游的啟動子作為重要的順式作用元件，克隆其啟動子序列，并對其進行功能分析，可為提高植物(作物)鹽分液泡區隔化的育種實踐提供重要的啟動子序列資源。

發明內容

本發明的目的在于避免現有技術的不足之處而提供一種鹽生草HgNHX基因啟動子序列，以豐富植物轉基因育種實踐中基因啟動子的選擇。

本發明的又一目的在于提供了一種鹽生草HgNHX基因啟動子序列的制備方法，并進行生物信息學分析，在能夠實現快速、準確的獲得該啟動子序列的同時，明晰了其序列特征。

本發明的還一目的在于提供了一種鹽生草HgNHX基因啟動子序列在植物抗逆轉基因技術領域中的應用。證實了鹽生草HgNHX基因啟動子屬于組成型啟動子類型，為其在植物轉基因育種實踐中的應用提供依據。

本發明以鹽生草HgNHX基因5’端上游1527bp核苷酸序列作為全長啟動子序列，以此為模板，設計不同的上游引物F1、F2、F3、F4及下游引物R，通過PCR擴增獲得HgNHX1 基因上游長度分別為615bp(SEQ NO1.)、938bp(SEQ NO2.)、1178bp(SEQ NO3.)和 1527bp(SEQNO4.)的缺失不同長度啟動子片段，分別命名為第一片段啟動子、第二片段啟動子、第三片段啟動子和HgNHX基因全長啟動子，并進行序列特征的生物信息學分析，然后分別與GUS報告基因融合后轉化擬南芥，并對陽性克隆植株不同組織、不同發育時期進行GUS染色檢測，確定各HgNHX基因缺失不同長度片段啟動子在轉基因植株中行使正常功能，具有組成型啟動子特性。