[發明專利]DVE強弱毒Real time PCR鑒別診斷的引物、探針及試劑盒

有效

• 申請號: 201710792730.3
• 申請日: 2017-09-05
• 公開（公告）號: CN107447048B
• 公開（公告）日: 2021-01-19
• 發明（設計）人: 萬春和;陳翠騰;劉榮昌;黃瑜;程龍飛;傅光華;傅秋玲;施少華;陳紅梅
• 申請（專利權）人: 福建省農業科學院畜牧獸醫研究所
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/6851;C12N15/11;C12R1/93
• 代理公司: 福州元創專利商標代理有限公司 35100
• 代理人: 蔡學俊

本發明提供鴨病毒性腸炎病毒（DVE）強弱毒實時熒光定量PCR鑒別診斷的引物、探針及試劑盒，所述引物和探針序列如SEQ ID NO.1?6所示，具有很高的特異性和靈敏度。當前國內外尚未見可同時對鴨病毒性腸炎病毒（DVE）強弱毒鑒別診斷的雙重TaqMan實時熒光定量PCR檢測方法的引物和探針的研究報道，本發明的建立可填補國內外相關領域空白。

技術領域

本發明提供鴨病毒性腸炎病毒（DVE）強弱毒實時熒光定量PCR鑒別診斷的引物、探針及試劑盒，屬于動物傳染病學領域。

背景技術

鴨病毒性腸炎(duck virus enteritis, DVE)，又稱鴨瘟(duck plague, DP)，是由鴨腸炎病毒(duck enteritis virus, DEV)引起的常見于鴨、鵝及其他雁形目禽類的一種急性、熱性、敗血性、高度接觸性傳染病。

我國的研究者從上世紀 60 年代開始研制 DVE 弱毒疫苗，其主要途徑是將 DEV強毒先在鴨胚上連續傳代，然后再轉接到雞胚上長期連續傳代，DEV 病毒對雞胚毒力增強的同時，逐漸喪失了對鴨的致病性，但對其仍保持較強的免疫原性。目前，我國使用的 DEV毒株為細胞傳代致弱毒株，在其免疫鴨后幾個小時就可產生一定程度的保護力。

實時熒光定量PCR方法（Real time PCR）是一種在DNA擴增反應中，以熒光化學物質檢測每次聚合酶鏈式反應（PCR）循環后產物總量的方法。實時熒光定量PCR是在PCR擴增過程中，通過熒光信號，對PCR進程進行實時檢測。由于在PCR擴增的指數時期，模板的Ct值和該模板的起始拷貝數存在線性關系。熒光探針法是用序列特異的熒光標記探針來檢測產物，探針法的出現使得定量PCR技術的特異性比常規PCR技術大大提高，目前常用的有TaqMan探針、FRET雜交探針(熒光共振能量傳遞探針)和分子信標molecular Beacon。TaqMan探針法是指PCR擴增時在加入一對引物的同時另外加入一個特異性的熒光探針，該探針只與模板特異性地結合，其結合位點在兩條引物之間。探針的5′端標記有熒光報告基團，如FAM、VIC、ROX、JOE等，3′端標記有熒光淬滅基團，如Eclipse、TAMRA等。實時熒光定量PCR技術在檢測病原時不僅可以定性檢測病原的有無，而且還可以定量分析病毒含量的多少，在病原核酸檢測技術上被廣泛使用。多重實時熒光定量PCR是一種特殊的熒光定量PCR形式，其突出的特點是一次實時熒光定量PCR反應可同時檢測多種病原，對病原復雜或存在多種基因型的病原鑒別檢測十分有效。

在皰疹病毒粒子DNA復制過程中涉及到多種酶，其中，由UL2基因編碼的尿嘧啶DNA糖基化酶（Uracil-DNA glycosylase，UDG）是DNA修飾不可缺少的酶，它能將復制過程中dUTP錯誤插入或是胞嘧啶的脫氨基造成的尿嘧啶殘基切除，保證DNA復制的正確性和順利進行。DEV的UL2是單純皰疹病毒1型(Herpes sim-plex virus type 1，HSV-1)的UL2的同源基因，后者編碼尿嘧啶 DNA 糖基化酶，是一個非必須基因，是對病毒復制發揮重要作用的一種酶。對DVE編碼的 UL2 基因核酸序列的同源性進行分析發現，DVE強毒株和DVE弱毒株在UL2基因編碼區存在較大差異，DVE弱毒株均發生了一個528bp的片段缺失，這段528bp 的序列占了UL2 基因的一半以上，可能導致 UL2 功能的喪失，提示這個片段缺失很可能與弱毒株的毒力減弱直接相關。因此，建立能夠同時對DVE強毒株和弱毒株進行鑒別診斷方法尤為重要。