[發明專利]一種純合轉基因油菜的制備方法

在審

• 申請號: 201710791071.1
• 申請日: 2017-09-05
• 公開（公告）號: CN107964550A
• 公開（公告）日: 2018-04-27
• 發明（設計）人: 殷麗琴;付紹紅;楊進;李云;王繼勝;李蘭
• 申請（專利權）人: 成都市農林科學院
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;A01H5/00;A01H1/08;A01H6/20
• 代理公司: 廣州三環專利商標代理有限公司44202
• 代理人: 張艷美,王志

技術領域

本發明涉及轉基因品種領域，尤其涉及一種純合轉基因油菜的制備方法。

背景技術

目前獲得純合轉基因油菜主要有兩種途徑，一是直接以二倍體油菜為對象，對種子或愈傷組織進行農桿菌侵染轉基因，之后對轉基因第一代植株進行自交，收獲轉基因第二代植株，進而不斷篩選出純合轉基因植株；二是先通過小孢子培養技術獲得單倍體油菜，再對單倍體植株進行轉基因，之后通過秋水仙素等化學加倍法對單倍體進行染色體加倍即通過人工染色體加倍，從而獲得純合的轉基因植株(如圖1所示)。第一種方法耗費大量的時間，至少需要2個世代才能獲得目標植株，有些甚至需要多自交幾個世代才能獲得目標轉基因的純合后代，第二種方法首先需要得到單倍體，而小孢子培養技術操作復雜、費時費力，且成功率較低，秋水仙素等加倍劑毒性大且容易導致嵌合體的產生。

因而，現有的獲得轉基因純合后代普遍存在的問題是：方法操作繁瑣，不能夠一步到位。主要原因有：轉基因對象多為雜合二倍體，轉入的基因常為單拷貝且為雜合狀態，需要至少經過1個世代的自交才能得到純合轉基因后代，且自交得到純合轉基因植株的效率不能達100％，想要得到數量較多的目標轉基因個體則至少還需要增加一個生育期，這就導致了試驗效率大大降低。或者，小孢子培養操作復雜，單倍體獲得率低，染色體加倍劑毒性大，化學加倍率不高，容易得到倍性嵌合體。

因此，急需提供一種新的操作簡便、周期短、誘導率高，毒性低的純合轉基因油菜的制備方法，以解決上述問題。

發明內容

本發明的目的是提供一種制備純合轉基因油菜的方法，其制備操作簡便、周期短、誘導率高。

為實現上述目的，本發明提供了一種純合轉基因油菜的制備方法，其制備過程包括下述步驟：

供體油菜的選擇；

花序浸染法浸染供體油菜；

雙單倍體誘導系技術對供體油菜進行后代誘導純合；

種子收集；

轉基因油菜篩選。

本發明通過花序浸染法對供體浸染，將目標轉基因轉到供體的雌配子中(即僅含有卵細胞)而非易產生不育的雄配子或受精后的合子中，再利用雙單倍體誘導系技術，通過受精后誘導系染色體組丟失和母本雌配子染色體組自發加倍，從而獲得純合的雙單倍體，即將轉基因和基因純合緊密聯系在一起，通過雙單倍體誘導系的刺激，使被轉基因的母本雌配子基因組發生自發加倍，省去了耗時的自交時間，避免了組織培養及化學加倍等環節，大大加快了育種進程，并通過一系列的轉基因油菜篩選步驟確保轉基因后代的純合性和血統的純正。

進一步的，供體油菜的選擇步驟包括選擇初花期前的油菜。選擇健壯植株上的主花序和第一次分株，選擇3-5天后即將開放的花蕾，此發育時期的油菜浸染轉化成功率較高，因為大量研究表明農桿菌是在心皮閉合之前進入子房室的。

進一步的，所述花序浸染法浸染供體油菜步驟包括將供體油菜的花序浸染在農桿菌菌液中。具體為將油菜花序浸染在農桿菌菌液中2～5min，套袋保持24小時的避光，連續浸染3～4次，每次間隔24小時。根據油菜花序發育情況，在農桿菌浸染前后進行去雄處理，用人工去雄或者機械化去雄僅留有雌蕊油菜進行后續花粉授粉。

進一步的，所述雙單倍體誘導系技術對供體油菜進行后代誘導純合步驟包括收集雙單倍體誘導系的油菜花粉，將油菜花粉涂抹在所述花序浸染法浸染供體油菜的柱頭上，并進行套袋處理。具體為收集雙單倍體誘導系的油菜花粉，將油菜花粉涂抹在所述花序浸染法浸染供體油菜的柱頭上，授粉后套袋處理，防止與其他花粉交叉污染。重復授粉3～4次，以保證誘導充分獲得純合雙單倍體。待花期結束后，去掉花粉紙袋。雙單倍體誘導系技術可采用八倍體供體給四倍體授粉、四倍體對二倍體授粉、二倍體對單倍體授粉，優選為八倍體對四倍體授粉，其能得到只含有母本基因組的純合后代。

油菜種類包括甘藍型油菜，白菜型油菜和芥菜型油菜，優選采用甘藍型油菜作為授粉對象，因為甘藍型油菜的花序中間花蕾著生位置高于開放花朵，開花時花藥一般內向開裂或半內向開裂，在進行花序浸染時，比較容易將目標轉基因轉到供體的雌配子中而非易產生不育的雄配子或受精后的合子中，同時甘藍型油菜自交親和性強，自交結實率高，更加激發了雙單倍體誘導系效果，大大加快了育種進程。

進一步的，所述轉基因油菜篩選步驟包括抗生素鑒定、PCR鑒定、倍性鑒定、分子純合性鑒定而進行油菜植株篩選。