[發(fā)明專利]一種抗蘋果壞死花葉病毒的抗血清及其制備方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201710790136.0
• 申請日: 2017-09-05
• 公開（公告）號: CN107446041B
• 公開（公告）日: 2021-04-06
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 李世訪;邢飛;王紅清
• 申請（專利權(quán)）人: 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護研究所
• 主分類號: C07K16/10
• 分類號: C07K16/10;C07K16/06;C07K14/08;C12N15/70;G01N33/68
• 代理公司: 北京紀凱知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11245
• 代理人: 關(guān)暢;張立娜

本發(fā)明公開了一種抗蘋果壞死花葉病毒的抗血清及其制備方法。本發(fā)明所提供的制備抗蘋果壞死花葉病毒的抗血清的方法包括如下步驟：以蘋果壞死花葉病毒的外殼蛋白作為免疫原免疫動物。本發(fā)明利用分子生物學(xué)手段通過在大腸桿菌中高效表達蘋果壞死花葉病毒的外殼蛋白基因，純化出目的蛋白，以其免疫新西蘭兔，制備得到了專一型的多克隆抗血清，本發(fā)明為該病毒的血清學(xué)檢測以及蘋果生產(chǎn)中該病害的防控提供理論基礎(chǔ)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于植物病毒學(xué)和免疫學(xué)領(lǐng)域，涉及一種抗蘋果壞死花葉病毒的抗血清及其制備方法。

背景技術(shù)

蘋果是我國重要的經(jīng)濟作物之一，F(xiàn)AO數(shù)據(jù)顯示，2014年，我國蘋果栽培總面積約227萬公頃，總產(chǎn)量約4100萬噸，分別占世界蘋果的50％左右，位居全球第一。我國蘋果栽培主要分布于陜西、山東、河北、河南、甘肅、山西、遼寧、新疆等省，已成為帶動地區(qū)發(fā)展的重要途徑，并逐漸成為產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)調(diào)整、經(jīng)濟發(fā)展的重要組成部分。但是，蘋果病毒病在我國蘋果產(chǎn)區(qū)的發(fā)生率較高，可達40-100％，一旦侵染，果樹將終生帶毒。其中，蘋果花葉病是蘋果生產(chǎn)中最常見的病毒性病害之一，嚴重制約著我國蘋果產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。

最近的一項研究表明，在蘋果花葉樣品中檢測到一種新的病毒——蘋果壞死花葉病毒(Apple necrotic mosaic virus,ApNMV)，ApNMV屬于雀麥花葉病毒科(Bromoviridae)等軸不穩(wěn)環(huán)斑病毒屬(Ilarvirus)第三亞組(Subgroup 3)，其基因組結(jié)構(gòu)為三分體，包括RNA1、RNA2和RNA3，其中RNA3的5’端編碼一個CP，由219aa組成，編碼區(qū)長度為660nt。另外，該新病毒ApNMV在我國蘋果花葉樣品中的檢出率高達82.6％，與花葉癥狀的發(fā)生存在較高的相關(guān)性，可能是導(dǎo)致我國蘋果花葉病的重要病原物，對我國蘋果栽培是一個嚴重的威脅。

病原檢測是病毒病防控的前提與基礎(chǔ)。目前，關(guān)于果樹病毒的檢測方法主要有生物學(xué)、血清學(xué)、電子顯微鏡觀察和分子生物學(xué)方法。其中，生物學(xué)方法檢測周期長、特異性差、工作量大，且對檢測人員的田間實踐經(jīng)驗要求較高；電鏡觀察雖然可以根據(jù)病毒和內(nèi)含體特征及寄主細胞病變情況，較為直觀地進行植物病毒的檢測，但同分子生物學(xué)一樣，該檢測方法受到實驗條件和檢測設(shè)備的限制，對大量樣品的檢測相對繁瑣。與之不同的是，血清學(xué)方法尤其是酶聯(lián)免疫吸附分析方法(ELISA法)因其能夠?qū)Υ罅繕悠愤M行快速、靈敏、準確的檢測，以及實驗成本低、方法簡單等優(yōu)點，成為植物病毒鑒定、分類以及檢測的重要工具。但是，國內(nèi)外尚無ApNMV血清制備及有效檢測的相關(guān)報道。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種抗蘋果壞死花葉病毒的抗血清及其制備方法。

本發(fā)明提供的制備抗蘋果壞死花葉病毒的抗血清的方法，包括如下步驟：以蘋果壞死花葉病毒的外殼蛋白作為免疫原免疫動物。

其中，所述蘋果壞死花葉病毒的外殼蛋白為如下任一：

(A1)氨基酸序列為序列表中的序列1的蛋白質(zhì)；

(A2)將序列表中序列1所示的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白質(zhì)；

(A3)與(A1)或(A2)所限定的氨基酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且具有相同功能的蛋白質(zhì)；

(A4)在(A1)-(A3)中任一所限定的蛋白質(zhì)的N端和/或C端連接標簽后得到的融合蛋白。

在所述方法中，所述動物具體可為新西蘭兔。

在所述方法中，免疫所述新西蘭兔可按照如下進行：將所述蘋果壞死花葉病毒的外殼蛋白與等體積的弗氏完全佐劑(首次)或弗氏不完全佐劑(后續(xù))進行乳化，使用SPF級新西蘭兔進行皮內(nèi)多點注射免疫，第一次免疫后休息一周，共免疫5-6次(如6次)，每次免疫所述蘋果壞死花葉病毒的外殼蛋白的用量為0.1mg。