[發明專利]mini-gene剪接報告質粒及其構建方法與應用

有效

• 申請號: 201710788244.4
• 申請日: 2017-09-05
• 公開（公告）號: CN107384917B
• 公開（公告）日: 2020-11-20
• 發明（設計）人: 張竹君;楊城;朱艷榮;鄧慧婷;李輝
• 申請（專利權）人: 南開大學
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11;C12Q1/6876;C12Q1/6806
• 代理公司: 天津市三利專利商標代理有限公司 12107
• 代理人: 李蕊

本發明提供了mini?gene剪接報告質粒及其構建方法與應用，所述mini?gene剪接報告質粒具有序列表4001所示序列，通過PCR擴增獲得三段DMD基因上的非連續序列，分別插入到pcDNA3.1中構建得到，可用于:1.鑒定和分析外顯子及內含子中的剪接調控元件；2.檢測微小突變(點突變和微缺失/重復)是否會對外顯子的剪接帶來影響。

技術領域

本發明涉及分子生物學領域，尤其是mini-gene剪接報告質粒及其構建方法與應用。

背景技術

RNA剪接是真核細胞基因表達中非常重要的一個生物過程，通過去除內含子并連接外顯子，可以產生許多具有功能的，帶有編碼信息的mRNA，它對生物的發育及進化至關重要。

mRNA前體的剪接就是在剪接體的催化下，除去內含子并將外顯子拼接起來形成成熟的mRNA的過程，是高等真核生物基因表達的必要步驟，也是蛋白質分子多樣性產生的關鍵機制之一。整個剪接過程是在細胞核中完成的，受到精細嚴格的調控。剪接位點的突變必然引起剪接模式的改變，正確的剪接位點序列及其位置都是保證RNA正常剪接的必要條件。剪接過程需要三個重要的剪接信號，分別是5’剪接位點(供體位點)、3’剪接位點(受體位點)和分支位點(內含子3’端附近)。5’端剪接位點一般是GU加上后續的幾個不是特別保守的堿基，3’端剪接位點區域含有多個保守元件，依次是分支點，多聚嘧啶區和內含子3’端的AG。此外，剪接過程還需要一些其它的順式調控元件的輔助作用，按照它們所在的位置和功能分為外顯子剪接增強子(ESE)、外顯子剪接沉默子(ESS)、內含子剪接增強子(ISE)、內含子剪接沉默子(ISS)四類。若某些核苷酸的改變影響了剪接信號和作用元件，基因的剪接模式將會改變從而導致某些疾病的發生。另一方面，通過改變基因的剪接模式還可以修飾某些疾病的臨床表型。隨著反義寡核苷酸藥物在臨床上的應用和發展，mini-gene可以明確影響剪接模式的特定核苷酸序列，從而為尋找藥物治療靶點提供了一個有效的方法。此外，mini-gene可以通過研究某些化合物對基因剪接模式的的影響來對一些靶向治療藥物進行篩選，可用于脊髓性肌肉萎縮、肌營養不良癥、家族性自主神經機能異常癥以及其他的遺傳性疾病的藥物篩選。

一般情況下，這些輔助調控元件通過招募一些反式作用因子即剪接調控蛋白來促進或抑制剪接位點的識別，并能通過調控剪接體的組裝來實現對剪接過程的調控。目前已知的剪接調控蛋白主要是富含絲氨酸/精氨酸蛋白(SR蛋白)家族和核不均一性核糖核蛋白(hnRNP)家族。一般情況下，SR蛋白結合在富嘌呤的ESE和ISE上，促進U1snRNP與5’ss結合、U2AF與3’ss結合，還有U4/U6-U5snRNP三聚體組裝到剪接體上，進而增強剪接的效率；hnRNP家族成員則通常結合在ESS和ISS上抑制剪接位點識別及使用。通過順式作用元件和反式作用因子復雜的相互作用才能實現正確的剪接過程。

在某些基因中由于剪接的供體、受體部位或其旁側保守序列的突變，改變RNA前體的剪接方式，使得產生的成熟RNA中含有內含子或缺失外顯子序列。剪接模式的正確性依賴于正確的剪接位點，而剪接模式發生錯誤與疾病關系重大，約1/4的遺傳病是由于基因突變改變了正常剪接位點而導致的。由于正常剪接位點與剪接系統有高度的親和性，一旦剪接點發生突變，會造成相應外顯子跳讀或鄰近的隱蔽剪接位點的活化，這些隱蔽剪接位點存在于內含子或外顯子中，因此在成熟mRNA分子中，就會保留一段內含子或缺失掉一段外顯子，有時還可使正常基因轉變成癌基因。大多數前體mRNA由于長度較大難以對其剪接作用進行研究，而且細胞中的一些內源性基因的突變也會改變剪接模式使得所表達的蛋白功能受到影響，因此對剪接作用的研究也尤為重要。另外，由于人類基因中會發生各種不同的突變，這些突變是否會對基因的剪接帶來影響也難以得知，這對掌握突變與剪接以及剪接與疾病之間的關系帶來困難。

發明內容

本發明所要解決的技術問題在于提供一種mini-gene剪接報告質粒。

本發明所要解決的另一技術問題在于提供上述mini-gene剪接報告質粒的構建方法。