[發明專利]一種快速檢測鑒定水稻潛根線蟲的LAMP引物和方法

有效

• 申請號: 201710786901.1
• 申請日: 2017-09-04
• 公開（公告）號: CN107502662B
• 公開（公告）日: 2021-07-09
• 發明（設計）人: 徐春玲;劉淑婷;韓玉春;丁善文;趙立榮;謝輝
• 申請（專利權）人: 華南農業大學
• 主分類號: C12Q1/6848
• 分類號: C12Q1/6848;C12Q1/6888;C12N15/11
• 代理公司: 廣州粵高專利商標代理有限公司 44102
• 代理人: 任重

本發明公開了一種快速檢測鑒定水稻潛根線蟲的LAMP引物和方法。所述引物包括外引物對Ho?F3和Ho?B3，以及內引物對Ho?FIP和Ho?BIP，序列分別如SEQ ID NO.1～4所示，并以該引物建立了LAMP檢測方法。本發明為水稻潛根線蟲的快速檢測鑒定和早期診斷提供了一個新的檢測方法，特異性強、準確性高、靈敏度高，且操作簡便、快速高效、簡便易行、成本低、判定直觀，實用性強、應用性廣，結果穩定性強、可信度高，而且還可以直接檢測混有不同種類的線蟲樣品中和植物組織樣品中的水稻潛根線蟲，無需樣品分離，對進出境口岸和調運檢疫以及田間病害早期診斷和監測工作中的水稻潛根線蟲快速檢測鑒定具有重要的意義。

技術領域

本發明屬于植物病原分子檢測鑒定技術領域。更具體地，涉及一種用LAMP引物和技術快速檢測鑒定水稻潛根線蟲的方法。

背景技術

水稻是主要的糧食作物，潛根屬Hirschmanniella Luc Goodey, 1964下的很多種類是水稻根部線蟲病害中最重要的病原線蟲，在根系內遷移危害，其中分布最廣、為害最大的種類是水稻潛根線蟲H. oryzae (van Breda de Hann, 1902) Luc Goodey, 1963。因此，水稻潛根線蟲的檢測鑒定對于相關病害的防治具有重要的意義。

水稻潛根線蟲的形態學鑒定主要根據頭部特征，口針基部球形狀，排泄孔位置，腸是否覆蓋直腸，尾部形態，側區的形態特征和蟲體體環類型，以及雌蟲的陰門和雄蟲的抱片形態特征。這些特征需要用高倍顯微鏡才可以觀察到，并且幼蟲不適用于用形態學方法鑒定，單以雄蟲的形態特征也不能鑒定到種。此外，潛根屬的形態常受到環境和地理條件的影響，通過形態學特征已難以區分潛根屬所有種類。因此，研究和使用分子生物學方法快速準確的檢測鑒定水稻潛根線蟲是非常有必要的。

目前對于潛根屬線蟲的分子序列信息研究尚少，GenBank數據庫中僅僅保存了10個種的序列。有研究報道了水稻潛根線蟲的PCR檢測方法，設計了水稻潛根線蟲的特異性引物，利用PCR技術對水稻潛根線蟲進行分子鑒定，該方法雖然具有準確、靈敏的特性，但需要用精密而昂貴的RCR儀，檢測過程復雜、時間較長，結果必須通過瓊脂糖凝膠電泳檢測才可以判定，不能滿足口岸和調運等基層檢疫以及田間監測的需求。

發明內容

本發明要解決的技術問題是克服現有水稻潛根線蟲檢測鑒定技術的缺陷和不足，為水稻潛根線蟲快速檢測鑒定提供一組LAMP引物和新的簡便實用的檢測方法，達到準確、靈敏、高效、簡便和快速鑒定的目的。

本發明的目的是提供一種快速檢測鑒定水稻潛根線蟲的LAMP引物。

本發明另一目的是提供一種快速檢測鑒定水稻潛根線蟲的LAMP方法。

本發明上述目的通過以下技術方案實現：

一種快速檢測鑒定水稻潛根線蟲的LAMP引物組，包括外引物對Ho-F3和Ho-B3，以及內引物對Ho-FIP和Ho-BIP，序列分別如SEQ ID NO.1～4所示。

所述述LAMP引物組在檢測鑒定水稻潛根線蟲方面的應用，以及在制備水稻潛根線蟲的檢測鑒定試劑或試劑盒方面的應用，也都應在本發明的保護范圍之內。

一種快速檢測鑒定水稻潛根線蟲的LAMP方法，以待測樣本DNA為模板，利用上述LAMP引物組進行LAMP擴增。

優選地，所述LAMP擴增的反應體系為：10×Thermopol Buffer 2.5μL、引物25倍混合液2μL、10 mmol/L dNTPs 3.5μL、100 mmol/L MgSO₄ 1.5μL、8U/μL Bst DNA聚合酶 1μL、模板 DNA 1μL、ddH₂O 補足25μL；其中，引物25倍混合液包括40μM引物Ho-FIP、40μM引物Ho-BIP、5μM引物Ho-F3、5μM引物Ho-B3。