[發明專利]一種大面積數字PCR微滴熒光高通量檢測裝置和方法

在審

• 申請號: 201710783914.3
• 申請日: 2017-09-04
• 公開（公告）號: CN107478629A
• 公開（公告）日: 2017-12-15
• 發明（設計）人: 周武平;黎海文;蔣克明;劉聰;張濤;劉聰;印晨宇
• 申請（專利權）人: 中國科學院蘇州生物醫學工程技術研究所
• 主分類號: G01N21/64
• 分類號: G01N21/64
• 代理公司: 北京遠大卓悅知識產權代理事務所(普通合伙)11369
• 代理人: 韓飛

技術領域

本發明涉及生物醫學檢驗領域核酸檢測領域，特別涉及一種能夠實現大面積數字PCR微滴熒光高通量檢測裝置和方法。

背景技術

在腫瘤早期診斷篩查、血液病毒分型及載量分析、無創產前診斷等領域，都需要對超低濃度的核酸進行高速高靈敏度高特異性的檢測，常規的PCR已越來越無法滿足需求。為實現此功能，人們在PCR基礎上，發展了一種數字PCR技術，將檢測靈敏度提高了1～2個數量級。

微滴式數字PCR采用的“分而治之”(divide and conquer)的檢測策略，將樣品、PCR試劑混合物作為分散相，將油作為連續相，利用微流控技術，將樣品混合物形成一個個液滴懸浮于連續相中。進而，將一個標準PCR擴增分配至大量微滴(納升至皮升)中，每個微滴中僅包含0個或1個拷貝的目標分子(DNA模板)。對每個微滴進行獨立PCR擴增，擴增結束后，檢測每個微滴的熒光，對陽性信號的微滴進行計數，從而得到樣品模板的絕對拷貝數和核酸濃度。微滴的尺寸和數量決定了數字PCR的檢測靈敏度和下限，現有的數字PCR微滴數在2萬～1000萬之間。

現有的商用微滴式數字PCR技術操作如下：在專用的微滴制備芯片上制備液滴；通過移液器將微滴轉移至離心管中，使用常規的PCR儀進行溫度循環擴增；擴增完成后，利用流式技術依次對每個微滴進行熒光激發與探測，計算結果。這樣的檢測方式存在以下問題：

(1)流式檢測速度較慢，檢測速度在200～500個/s，檢測過程耗時久，通量低；

(2)只能對單個微滴進行終點法檢測,不能實時qPCR，降低了特異性和靈敏度；

(3)光路硬件復雜，難以實現多重數字PCR檢測(4重以上)；

(4)兩次液滴的轉移過程將導致微滴損失，以及可能引來的外界污染；

(5)常規PCR擴增儀的加熱塊熱慣量大，熱循環時間長(2小時左右)。

為解決上述五個問題，申請人已提出了一體式數字PCR芯片，并已申請發明專利(申請號201510961967.0)。參見附圖1，一體式數字PCR芯片包括本體1，位于其上的連續相注入孔11、樣品注入孔12、單層微滴平鋪腔體15、真空接入孔16、用于生成微滴的“+字型”微結構13，以及用于連接連續相注入孔11和“+字型”微結構13的液路14、用于連接樣品注入孔12和“+字型”微結構13的第一液路17、用于連接“+字型”微結構13和單層微滴平鋪腔體15的第二液路18。通過MEMS工藝將所述所有微結構制作于一片聚合物基板上，隨后與另一塊聚合物平板相鍵合而形成封閉的微流道系統，在連續相注入孔11、樣品注入孔12、真空接入孔16三處開孔，用于注入樣品和施加負壓。

參照圖2，其基本原理為：在連續相注入孔11注入油、樣品注入孔12注入樣品后，在真空接入孔16施加真空負壓，樣品、連續相將在負壓的作用下，通過流道14和17到達“+字型”微結構13。在此處，樣品將因連續相的剪切而形成一個個納升級微滴20，隨后經過流道18進入單層微滴平鋪腔體15，平鋪成微滴單層19。

該技術方法具有以下優勢：微滴單層19適用于使用CCD進行圖像化熒光拍照檢測，具有較高的通量和速度；通過連續熒光圖像檢測可以獲得微滴熒光隨循環此時的變化曲線，進行單液滴qPCR檢測，具有較高靈敏度和特異性；通過增加激發光源和濾光片，可輕易實現多重數字PCR；整個過程一體化完成，不存在微滴損失和外界的污染。最后，單層微滴將具有較大的溫控面積和較小的熱慣量，可以將PCR循環擴增時間降低至半小時以內。

為了利用該數字PCR芯片進行核酸檢測，一方面需要對該數字PCR微流控芯片進行溫度循環擴增，另一方面需要對數字PCR液滴單層進行實時激光激發和熒光成像探測。每溫度循環一次，便進行一次液滴熒光圖像檢測，以獲得每個液滴的熒光連續變化曲線。為提高通量，在一塊芯片上，可集成多個一體式數字PCR微流控結構，形成32個、48個甚至96個樣品的同時檢測(參照圖3)，以便提高通量，這樣便需要芯片可以進行一維或二維的運動，以便可以通過掃描方式進行大面積圖像采集。另外，為提高檢測效率，采用一種新算法，先通過小倍率進行粗略大視場觀看，發現可能存在液滴熒光點后，切換成高倍率精細小視場觀測的方式，以提高效率。但現有的檢測裝置如熒光顯微鏡等，無法滿足上述檢測要求。

發明內容

本發明的一個目的是解決至少上述問題和/或缺陷，并提供至少后面將說明的優點。