[發明專利]一種肝素測定的試劑盒

在審

• 申請號: 201710779609.7
• 申請日: 2017-09-01
• 公開（公告）號: CN107727872A
• 公開（公告）日: 2018-02-23
• 發明（設計）人: 謝永華
• 申請（專利權）人: 上海太陽生物技術有限公司
• 主分類號: G01N33/86
• 分類號: G01N33/86;G01N33/535
• 代理公司: 北京集佳知識產權代理有限公司11227
• 代理人: 劉偉,趙青朵

技術領域

本發明屬于醫學體外診斷領域，具體涉及一種肝素測定的試劑盒，尤其是涉及一種發色底物法(一步法)檢測肝素活性的肝素測定試劑盒。

背景技術

肝素是一種酸性黏多糖，由分布在腸黏膜的肥大細胞合成。正常人血液中含量極少，生理情況下其抗凝作用很小。它可通過加速抗凝血酶、HCⅡ起抗凝作用，對TFPI和蛋白C系統也有影響。天然肝素是不均一的，其分子量在3-57kD之間(王振義.血栓與止血基礎理論與臨床[M].第三版.上海：上海科學基礎出版社，2004:119-119)。臨床上把肝素作為抗凝劑藥物而廣泛使用，主要用于血栓性疾病的治療及心血管手術上、血液透析、體外循環等過程的抗凝處理。

肝素是臨床醫學中一種最常用的抗凝治療劑，肝素類藥物在抗血栓藥物中占有極大的市場份額，其中又以低分子肝素類藥物占主導。作為藥物，肝素活性功能的精確檢測無論對于生產過程的質量控制還是臨床治療中患者的動態監控均具有重要的意義。目前肝素測定方法主要為凝固法和發色底物法(US4234682、US 4948724、US 5308755 A、CN104048931A、CN 103063592 A、CN103323416A；Ten C H,Lamping R J,Henny C P,et al.Automated amidolytic method for determining heparin,a heparinoid,and a low-Mr heparin fragment,based on their anti-Xa activity[J].Clinical Chemistry,1984,30(6):860-864)。凝固法是較為傳統的肝素活性測定方法，其操作繁瑣、專屬性差、耗時費力、精確度低，而發色底物法利用肝素糖鏈中含有與抗凝血酶高親和的五糖結構域，能夠特異性結合體內抗凝血酶(AT)，形成肝素-抗凝血酶復合物，肝素-抗凝血酶復合物能夠抑制活化的凝血因子Ⅹ(或凝血因子Ⅱ)水解發色底物的顯色反應的基本原理，具有靈敏度高、操作簡便、特異性強的特點。研究顯示在抗Ⅹa因子相互作用過程中，只需含肝素核心五糖結構域糖鏈激活AT進而達到抗凝血的目的；在抗Ⅱa因子相互作用過程中不僅需要肝素包含有核心五糖結構域，還要包括至少十八個單糖組成的糖鏈(Lane D A,Denton J,Flynn A M,et al.Anticoagulant activities of heparin oligosaccharides and their neutralization by platelet factor 4.[J].Biochemical Journal,1984,218(3):725-732)。目前國際上已有用發色底物法取代血液凝固法的趨勢。在第六次肝素國際標準品協作標定中，WHO已將抗Ⅹa因子和抗Ⅱa因子活性測定作為推薦使用的標定方法，美國藥典第37版以及歐洲藥典第8.3版均采用該方法測定肝素效價。2015年版的《中國藥典》肝素效價的測定方法也將凝固法改為發色底物法測定肝素抗Ⅱa因子活性。

臨床上使用試劑盒測定以有效地反應肝素在血漿中的濃度，目前市面上有許多商品化的肝素測定試劑盒出售，絕大多數產品為發色底物法且多為進口產品。市面上采用發色底物法的肝素測定試劑盒有兩種，一種是兩步法，該法不依賴于血漿中的AT含量，檢測樣品血漿中總肝素含量。該法的肝素測定試劑盒有兩類，一類市售試劑盒中包含抗凝血酶(AT)、牛FⅩa或者人FⅩa、緩沖液和發色底物，如Sekisui公司的Heparin(Anti-FⅩa)、IL公司的Heparin-0020009400、Siemens公司的Heparin、Stago公司的Heparin及Aniara公司的Biophen Heparin anti-Ⅹa(2stages)等，另一類市售試劑盒中包含抗凝血酶(AT)、牛FⅡa、緩沖液和發色底物，如Sekisui公司的Heparin(Anti-FⅡa)及Aniara公司Biophen Heparin anti-Ⅱa(2stages)等，此類試劑無法用于檢測低分子量肝素(LMWH)。另外一種是一步法，該法市售試劑盒中包含牛FⅩa和發色底物，如IL公司的Liquid Heparin-0020300100，Aniara Biophen Heparin LRT(液體)及Biophen Heparin(凍干)等，該法檢測樣品血漿中起抗凝作用的肝素。