[發明專利]一種凝結芽孢桿菌的篩選方法

在審

• 申請號: 201710775778.3
• 申請日: 2017-08-31
• 公開（公告）號: CN107418920A
• 公開（公告）日: 2017-12-01
• 發明（設計）人: 方曙光;嚴濤;姜甜;吳明科;朱建國
• 申請（專利權）人: 江蘇微康生物科技有限公司
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12N1/02;C12Q1/68;C12Q1/04;C12R1/07
• 代理公司: 北京易捷勝知識產權代理事務所(普通合伙)11613
• 代理人: 齊勝杰

技術領域

本發明涉及微生物技術領域，尤其涉及一種凝結芽孢桿菌的篩選方法。

背景技術

凝結芽孢桿菌(Bacillus coagulans)是一類能形成芽孢的產乳酸細菌，被美國食品與藥物管理局(FDA)和美國飼料控制官員協會列入可用于飼料的安全微生物菌種名單，它除了具有一般乳酸菌的維持腸道微生態平衡、刺激免疫、提高機體健康水平、提高人和動物消化功能等作用外，同時由于其能產生芽孢，具有抗逆性強、抗胃酸、抗干燥、耐高溫高壓和易貯存等獨特的生物特性，其廣泛分布于土壤、植物根際、動物糞便和許多人類食品中。

產乳酸芽孢桿菌的研究已成為益生菌菌株研發的熱點。然而，凝結芽孢桿菌的開發，關鍵技術在于菌種的篩選，從什么途徑、用什么方法篩選出這種菌株。現有技術的篩選方法，多根據其所具有的生物學和功能特征，這些方法可對其進行初步篩選，但是篩選工作繁重、周期長，且篩選準確性較低。

發明內容

為解決上述技術問題，本發明的目的是提供一種簡單、高效且準確性高的凝結芽孢桿菌的篩選方法。

本發明的凝結芽孢桿菌的篩選方法，包括以下步驟：

S1、將含凝結芽孢桿菌的樣品溶于無菌水中，55℃-65℃水浴處理一段時間，得到混合菌種水溶液；

S2、取一定混合菌種水溶液，接種于可溶性淀粉培養基，培養一段時間，得到混合菌液；

S3、將混合菌液稀釋后，涂布于溴甲酚紫葡萄糖固體平板，培養一段時間，挑取有黃色暈圈的菌落，分離純化；

S4、使用PCR擴增和/或16s RNA測序比對的方法，鑒定篩選挑取的菌落，得到凝結芽孢桿菌。

進一步的，所述PCR擴增方法所采用的特異性引物的序列分別如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示。

進一步的，所述16s RNA測序比對方法中PCR擴增目標測序模板所采用的特異性引物的序列分別如SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示。

進一步的，所示樣品分離自斷奶仔豬腸道內容物。

具體的，所述步驟S1中水浴處理時間為5-10min。

具體的，所述步驟S2中培養條件為45℃-50℃、150-200r/min下培養30-36h。

具體的，所述步驟S3中培養條件為45℃-50℃培養36-48h。

借由上述方案，本發明至少具有以下優點：針對凝結芽孢桿菌的特點，采用特定篩選條件與特異性引物相結合的方法，準確性高、針對性強和節省時間，快速篩選得到凝結芽孢桿菌。

上述說明僅是本發明技術方案的概述，為了能夠更清楚了解本發明的技術手段，并可依照說明書的內容予以實施，以下以本發明的較佳實施例并配合附圖詳細說明如后。

附圖說明

圖1是PCR產物的瓊脂糖凝膠電泳分析；

圖2是16S rRNA序列基因比對結果。

具體實施方式

下面結合附圖和實施例，對本發明的具體實施方式作進一步詳細描述。以下實施例用于說明本發明，但不用來限制本發明的范圍。

實施例1

本實施例提供一種凝結芽孢桿菌的分離純化方法，包括以下步驟：

S1、取斷奶仔豬腸道內容物5-10g，放入裝有10倍于樣品的含小玻璃珠的無菌生理鹽水中，振蕩5-10min，使之搖勻。

S2、將樣品懸液置于55℃-65℃水浴處理5-10min后，吸取2mL接種于可溶性淀粉培養基中，45℃-50℃，150-200r/min培養30-36h。

S3、取培養后的菌液進行10倍梯度稀釋，取適宜稀釋梯度涂布于溴甲酚紫葡萄糖固體平板上，45-50℃培養36-48h。待菌落長出后，挑取有黃色暈圈的菌落，分離純化，編號為1-5保存。

本實施例針對凝結芽孢桿菌耐高溫、產芽孢、產淀粉酶、產酸的特點，采用特殊的處理方法以分離純化：1)熱處理(55℃-65℃)殺死一些對溫度敏感的微生物，篩選出能耐高溫的菌株；2)凝結芽孢桿菌能產生淀粉酶，能將淀粉水解成葡萄糖作為碳源進行生長，在只有淀粉作為碳源情況下，篩選出能產淀粉酶來分解利用淀粉的菌株，進一步縮小篩選范圍；3)溴甲酚紫葡萄糖固體平板作為一種指示劑平板，在酸性條件下，其顏色會由紫色變成黃色，而凝結芽孢桿菌在生長過程中會產酸，菌落周圍呈酸性，因此，其菌落周圍會產生黃色暈圈，經過前兩步篩選過程，包括凝結芽孢桿菌在內，此時只有少量菌落能產出黃色暈圈。

實施例2