[發明專利]一種基于少量細胞全基因組染色質高分辨率構象技術eHi-C 2.0

有效

• 申請號: 201710773996.3
• 申請日: 2017-08-31
• 公開（公告）號: CN107475394B
• 公開（公告）日: 2021-06-15
• 發明（設計）人: 張玉波;孔思遠;黃其通;李琳;黃雷;白立景;彭艷玲
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院農業基因組研究所
• 主分類號: C12Q1/6869
• 分類號: C12Q1/6869;C40B50/06;C40B40/06;C12N15/10
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司 11245
• 代理人: 關暢;白艷

1.一種細胞eHi-C 2.0測序文庫的制備方法，包括如下步驟：

1）裂解細胞得到染色質，再酶切所述染色質，得到酶切后DNA；

所述酶切所用的限制性內切酶為HpyCH4IV和MboI；

2）將所述酶切后DNA依次經標記物標記和鈍端連接，得到環化產物；

3）向所述環化產物中引入內參環狀共沉淀DNA分子，得到混合物；再用限制性外切酶酶切所述混合物，得到去除線性DNA分子的混合物；

所述限制性外切酶為Lambda和Exonuclease I；

4）將所述去除線性DNA分子的混合物進行超聲打斷，再用免疫磁珠從打斷產物中抓取帶有所述標記物的DNA片段；

5）用所述帶有所述標記物的DNA片段制備eHi-C 2.0測序文庫；

所述裂解細胞為依次裂解所述細胞的細胞膜和細胞核，得到染色質；

所述裂解細胞的細胞膜包括如下步驟：用含有質量百分含量0.1% SDS 和質量百分含量1% PI的裂解緩沖液裂解細胞，離心收集上清液，得到裂解后產物；所述離心的條件為4℃500g離心15min；

所述裂解所述細胞核為先用含有質量百分含量為1% SDS和質量百分含量1% PI的裂解緩沖液裂解，再用含有質量百分含量0.1% SDS 和質量百分含量1% PI的裂解緩沖液裂解，離心收集上清液，得到染色質；

所述內參環狀共沉淀DNA分子為環狀質粒；所述環狀質粒為質粒PGL 4.23；

所述用帶有所述標記物的DNA片段制備eHi-C 2.0測序文庫依次包括如下步驟：將帶有所述標記物的DNA片段依次末端修復、加尾反應、加接頭、PCR擴增和選擇文庫。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于：

所述PCR擴增的條件為：先98℃預變性1 min；再98℃變性15s，60℃退火30s，72℃延伸30s，共進行11個循環；再72℃延伸5min。

3.根據權利要求1或2所述的方法，其特征在于：

所述步驟1）中所述酶切為將所述染色質用限制性內切酶緩沖液重懸，得到重懸后染色質；將所述重懸后染色質和所述限制性內切酶混勻，反應，得到酶切后DNA。

4.根據權利要求1或2所述方法，其特征在于：

所述標記物標記為將帶有生物素的dNTP引入所述酶切后DNA中；

或所述鈍端連接的條件為16℃孵育12-18h；

或，在所述標記物標記和所述鈍端連接之間還包括如下步驟：向所述標記物標記的產物中加入SDS孵育，所述SDS在所述孵育的反應體系中的質量百分含量為1.5%；

或，在步驟2）的鈍端連接后還包括如下步驟：向所述環化產物中加入SDS孵育，所述SDS在所述孵育的反應體系中的質量百分含量為1-1.5%。

5.根據權利要求1或2所述的方法，其特征在于：

在所述步驟2）和3）之間以及所述步驟3）和4）之間，均有將上一步產物進行DNA純化的步驟，

所述DNA純化采用磁珠純化的方式；

所述步驟2）和3）之間磁珠純化采用磁珠原液的稀釋液進行，所述稀釋液的稀釋倍數為16倍；

所述步驟3）和4）之間磁珠純化采用磁珠原液進行。

6.根據權利要求1或2所述的方法，其特征在于：步驟1）中，所述細胞的數量為小于1million。

7.根據權利要求6所述的方法，其特征在于：所述細胞的數量為0.1-0.3 million。

8.權利要求1-7中任一所述方法在細胞eHi-C 2.0測序中的應用。